【摘要】：本研究將熱酚水法提純羊布魯菌(16M菌株)的脂多糖(LPS)和滅活羊種布魯菌(16M)作為免疫抗原,交替免疫6～8周齡Balb/c雌鼠。第一次免疫用羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌16M全菌加等量弗氏完全佐劑;第二次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐劑。第三次免疫用羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌16M全菌(本次不加佐劑);第四次用脂多糖(本次不加佐劑),每次免疫間隔十天。四免后,測其ELISA效價達到1:10000以上的,用脂多糖(LPS)抗原腹腔超強免疫一次,三天后取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合。 用熱酚水法提純羊布魯菌(16M菌株)的脂多糖作為包被抗原建立間接ELISA方法,篩選抗羊種布魯菌(16M菌株)脂多糖的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。采用有限稀釋法,經(jīng)過3～4次克隆,最終獲得12株分泌抗羊種布魯菌脂多糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為:4A11、6B8、3H7、4D4、3E3、3F9、6E3、6F2、2C3、5D11、4C3、5H3。經(jīng)過亞類鑒定,其中3E3和6E3是IgG1亞類,3F9、2C3、5D11、3H7和4D4是IgG3亞類,4C3為IgG2a亞類,而6F2、5H3、6B8、4A11是IgM亞類。選擇其中兩株雜交瘤細(xì)胞(4D4和3H7)進行染色體分析,試驗結(jié)果所得平均染色體數(shù)目在92～108之間,符合SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目與正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目之和,表明所獲得的抗體分泌細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞。對其中3株雜交瘤細(xì)胞(6B8、5H3和3H7)進行特異性檢測,結(jié)果顯示該3株單抗只與滅活的羊種布魯菌16M裂解抗原發(fā)生反應(yīng),呈現(xiàn)陽性;而不與大腸桿菌O157裂解抗原、雞白痢沙門菌裂解抗原、鴨源雞桿菌1-S脂多糖抗原以及福氏志賀菌解抗原反應(yīng)�；⒓t凝集試驗和試管凝集試驗進一步證實此3株單抗具有很強的特異性。經(jīng)檢測,所得12株抗羊種布魯菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA效價在1:1000～1:10000之間,小鼠腹水單克隆抗體ELISA效價為1:160000。對其中5株雜交瘤細(xì)胞(6B8、3E3、3F9、6E3、6F2)進行連續(xù)傳10、20、30代和3次凍融復(fù)蘇后,雜交瘤細(xì)胞生長旺盛,雖然有部分雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力有些輕微下降,但分泌抗體能力并沒有消失,仍能穩(wěn)定分泌高效價抗體,說明所獲得的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體能力穩(wěn)定。 利用所建立的單克隆抗體細(xì)胞株,建立了一種檢測布魯菌的雙夾心間接ELISA方法,并進行了特異性和敏感性檢測。對模擬樣品水樣兩份(S1、S2)、奶樣兩份(S3、S4)、土樣兩份(S5、S6)進行了檢測,準(zhǔn)確性均很高。
[Abstract]:In this study, lipopolysaccharide (LPS) and inactivated sheep strain Brucella (16M) were purified by thermophenol water method as immune antigens, and Balb/c female mice aged 6 to 8 weeks were immunized alternately. The standard strain of Brucella sheep for the first immunization was 16m and the same amount of Freund's complete adjuvant was added to the whole bacterium, and the lipopolysaccharide was added with the same amount of Freund's incomplete adjuvant for the second immunization. The standard strain of Brucella was 16m (this time without adjuvant) and lipopolysaccharide (no adjuvant was added) for the third immunization, the interval of immunization was ten days. After four immunizations, the ELISA titers of the mice whose ELISA titers were more than 1: 10 000 were tested. The lipopolysaccharide (LPS) antigen was used to immunize the spleen cells of mice with SP2/0 myeloma cells once, and three days later, the spleen cells of mice were fused with SP2/0 myeloma cells. The indirect ELISA method was established by purification of lipopolysaccharide from Brucella sheep (16M strain) by thermophenol water method. The monoclonal antibody hybridoma cell lines against lipopolysaccharide of Brucella suis (16M strain) were screened. 12 hybridoma cell lines secreting lipopolysaccharide against Brucella sibiricus were obtained by limited dilution method. The hybridoma cell lines were named 4A116B8H7H7H7D4D4E3E3E3E3F9C3F2C3D114C3C3H3H3, respectively. The results showed that 3E3 and 6E3 were IgG1 subclasses, 3F9C3D113H7 and 4D4 were IgG3 subclasses, 4C3 were IgG2a subclasses, and 6F2H3H3B8A11 subclasses were IgM subclasses. Two of the hybridoma cells (4D4 and 3H7) were selected for chromosome analysis. The results showed that the average number of chromosomes was between 922 and 108, which corresponded to the sum of the chromosome number of SP2/0 cells and that of normal mouse spleen cells. The results showed that the antibody secreting cells were hybridoma cells. Three of the hybridoma cells (6B8H3 and 3H7) were detected specifically. The results showed that the McAbs reacted with 16M lytic antigen of inactivated brucellosis. It did not react with Escherichia coli O157 lytic antigen, Salmonella pullorum lytic antigen, 1-S lipopolysaccharide antigen and Shigella flexneri lytic antigen. Tiger red agglutination test and test tube agglutination test further confirmed that the three McAbs have strong specificity. The results showed that the ELISA titer of the supernatant of 12 hybridoma cells was 1: 1000: 110000, and the ELISA titer of mouse ascites monoclonal antibody was 1: 160000. Five of the hybridoma cells (6B8O3E3E3F9C3E3O6F2) were transferred continuously for 1020 / 30 passages and 3 times of freeze-thaw resuscitation. Although some hybridoma cells had a slight decrease in the ability to secrete antibodies, the ability of secreting antibodies did not disappear. The high titer antibody can still be secreted stably, which indicates that the hybridoma cell line is stable in secreting antibody. A double sandwich indirect ELISA method for the detection of brucellosis was established by using the established monoclonal antibody cell line. The specificity and sensitivity of the method were tested. Two water samples (S _ 1 / S _ 2), two milk samples (S _ 3 / S _ 4) and two soil samples (S _ 5 / S _ 6) were tested.
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2396987