【摘要】：腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由漢坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠類為主要傳染源的一種自然疫源性疾病，，又稱流行性出血熱（epidemic hemorrhagic fever，EHF），簡稱出血熱。全球每年新發(fā)病例有90%左右在中國；死亡率在2%~10%左右。該病在我國絕大多數省區(qū)流行，病情危急，危害很大。漢灘病毒（hantaan virus， HTNV）和漢城病毒（Seoul virus， SEOV）是我國HFRS的兩種主要病原體。 漢坦病毒感染可引起機體明顯的適應性免疫應答。體液免疫應答強烈而持久；細胞免疫可能在免疫保護和免疫病理損傷兩方面都有作用。漢坦病毒核蛋白是誘導體液免疫應答主要的免疫原，可在發(fā)病數天內引起抗體應答。因此，重組核蛋白常被用來檢測患者血清中病毒特異性抗體的類型和水平，為HFRS的診斷提供依據。糖蛋白免疫原性較弱，糖蛋白特異性抗體出現稍晚，多在病程中后期。但是，一般認為漢坦病毒糖蛋白是誘導中和抗體產生的主要來源；而據報道，中和抗體出現的早晚與患者的病情及預后密切相關。人感染漢坦病毒后，血清病毒特異性IgG水平隨時間延長不斷升高，一般于恢復早期達到平臺期；持續(xù)時間長，有時在病愈后數十年仍可檢測到。 抗體的產生離不開抗原特異性B細胞的活化、增殖、分化；抗原特異性B細胞接觸并結合抗原是體液免疫應答的始動環(huán)節(jié)；而這離不開B細胞受體（B cell receptor, BCR）對抗原的有效識別�？乖cBCR相互識別、發(fā)生作用的結構叫做抗原決定簇（antigenic determinants），又稱表位(epitope)。表位是抗原與抗體發(fā)生作用的主要部位，是抗體識別抗原的結構基礎。 研究漢坦病毒結構蛋白特異性抗體識別的B細胞表位對于深入認識病毒致病和抗體產生機制，中和抗體的免疫保護作用，以及研發(fā)新的診斷材料、亞單位疫苗等具有重要意義。目前，有關漢灘病毒結構蛋白B細胞表位的報道較少，尚缺乏系統(tǒng)的研究。 本論文首次采用合成的重疊多肽對HFRS患者血清抗體識別的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）線性B細胞表位進行了系統(tǒng)分析。把覆蓋HTNV NP氨基酸全序列的70條重疊15肽包被于ELISA板，用間接ELISA法篩選了35例HFRS患者血清抗體識別的線性B細胞表位，并用競爭ELISA證實了患者血清抗體與抗原肽結合的特異性。發(fā)現HFRS患者血清抗體識別的線性B細胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次為NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部僅有數個線性B細胞表位。發(fā)現一些患者血清抗原肽特異性IgG水平在急性期可有不同的變化。 同時，我們合成了覆蓋HTNV GP氨基酸全序列的281條重疊15肽，利用間接ELISA和點雜交兩種PepScan法對3D8、3G1、8G3這3株鼠源性中和抗體識別的B細胞表位進行表位作圖。首先，將合成的281條重疊多肽分成28組，每10條肽為一組，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株單克隆抗體做粗篩；然后將與單克隆抗體呈陽性反應的混合肽中各組成肽分別包被ELISA板或NC膜繼續(xù)用單克隆抗體反應，做細篩，從而確定各單克隆抗體識別的抗原肽。然后用競爭ELISA證實抗原肽與中和抗體結合的特異性。我們發(fā)現單克隆抗體3D8和8G3識別HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而單克隆抗體3G1可能識別由數個線性肽組成的構象表位。由于原合成肽相鄰肽間相差4個氨基酸殘基，因此又追加合成了與881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分別相差3個、2個、1個氨基酸殘基的15肽。將這些肽包被于ELISA板或NC膜上與單克隆抗體3D8反應，進行單克隆抗體3D8識別線性B細胞表位的精細定位。我們發(fā)現單克隆抗體3D8與882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反應最強烈。接著，用丙氨酸掃描突變法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896這條抗原肽發(fā)揮主要作用的氨基酸殘基，發(fā)現aa885C、aa896C是該抗原肽表位最關鍵的氨基酸殘基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K對單克隆抗體3D8識別這個抗原肽表位也有重要影響。 本論文首次系統(tǒng)分析了腎綜合征出血熱患者血清抗體識別的HTNV核蛋白線性B細胞表位，對具有中和作用的單克隆抗體3D8的B細胞表位作圖確定了漢灘病毒糖蛋白上一個新的中和表位。這一結果不僅為深入探討HTNV感染引起的體液免疫應答規(guī)律以及研制新型疫苗提供了理論依據，同時為搞清單克隆抗體3D8作為HFRS治療性抗體的抗病毒感染機制提供了重要的實驗依據。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2391145