【摘要】：單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下簡稱LM)是一種常見的革蘭氏陽性食源性致病菌,屬于李斯特菌屬,是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌。在美國及歐洲等西方發(fā)達國家,臨床發(fā)病率大約為十萬分之二到八,死亡率為百分之二十到三十。由于該菌在自然界廣泛存在,且能夠在高鹽(10% NaCl)、長時間干燥及較寬的pH (pH 4.5-9.0)和溫度(0-45℃)等多種環(huán)境中生存,導致食品在加工及運輸過程中易受其污染,通過攝入污染的食品引起李斯特菌病的發(fā)生。當LM進入人體胃腸道后,首先要耐受胃腸道內(nèi)復雜的生理生化環(huán)境,包括胃酸所導致的低pH環(huán)境,腸道中高滲透壓及膽囊分泌到腸道中的膽汁酸鹽等,然后突破胃腸屏障進入細胞和血循環(huán)中,進而侵染肝、脾和腦等內(nèi)部組織和器官。因此,LM能否耐受胃腸道系統(tǒng)中極端環(huán)境的脅迫是其成功侵染宿主細胞的先決條件。目前研究發(fā)現(xiàn),LM對環(huán)境的耐受能力以及致病性的高低與如下兩種調(diào)控因子的作用息息相關： (1)壓力調(diào)控因子Sigma B (σB)。σB由sigB基因編碼,存在于許多低G+C含量的革蘭氏陽性致病菌屬中。LM通過σB啟動與壓力脅迫相關基因的表達,以增強其對不利環(huán)境的適應。這些基因包括與耐受氧化,以及高或低的滲透壓、酸堿、溫度和膽汁酸鹽等壓力脅迫相關的基因。這些相關基因的表達對于LM在千變?nèi)f化的環(huán)境中生存,進而侵入宿主,并在宿主中生存繁殖,最終引起宿主致病等方面起著重要的作用。 (2)毒力基因調(diào)控蛋白PrfA。PrfA由prfA基因編碼,prfA與hly、plcA、plcB、mpl及actA共同組成LM基因組上一段9kb長的基因簇,即LM毒力島Ⅰ(LIPI-Ⅰ),其編碼的毒力蛋白在侵染宿主細胞的過程中發(fā)揮著至關重要的作用。迄今發(fā)現(xiàn),包括毒力島Ⅰ在內(nèi)的大多數(shù)毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達受到PrfA的調(diào)控。PrfA通過特異性識別并結(jié)合到靶基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始點上游約40 bp處的一段14 bp長的回紋保守序列(TTAACANNTGTTAA, N代表TCGA中任一堿基),即所謂的PrfA-box,從而直接調(diào)控毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達。同時,PrfA也通過與其它調(diào)節(jié)因子的相互作用從而間接參與細菌細胞的各種生理活動。 研究發(fā)現(xiàn),某些毒力基因的的啟動子區(qū)域同時存在PrfA(?)σB的結(jié)合位點,例如與膽汁鹽降解直接相關的bsh(編碼膽汁酸鹽水解酶)基因。而且,prfA上游的兩個啟動子中的P2啟動子上存在一套完整的σB的保守序列(GTTA-N16-GGGTAT),該啟動子的轉(zhuǎn)錄嚴格依賴σB,暗示環(huán)境脅迫和毒力基因表達調(diào)控之間存在一定關聯(lián)。 為了探究σB和PrfA因子在LM耐受膽汁酸鹽的過程中所起的作用,本文利用高通量的蛋白質(zhì)組學方法,比較研究了LM野生株EGD、EGD△prfA (PrfA單缺失)、EGD△sigB (Sigma B的單缺失)和EGD△prfA△sigB (PrfA和Sigma B雙缺失)四種菌在無膽汁酸鹽,以及中(0.3%)和高(3%)濃度膽汁酸鹽刺激下總蛋白的差異表達,結(jié)果如下： (1)通過比較LM野生菌株EGD與相同濃度膽汁酸鹽刺激下sigB基因缺失菌株EGD△sigB總蛋白表達圖譜的差異,找出膽汁酸鹽刺激條件下受σB因子調(diào)控的蛋白差異點6個； (2)通過比較野生菌株EGD與相同濃度膽汁酸鹽刺激下prfA基因缺失菌株EGD△prfA總蛋白表達圖譜的差異,找出膽汁酸鹽刺激條件下受PrfA因子調(diào)控的蛋白差異點8個； (3)通過比較野生菌株EGD與雙缺失菌株EGD△prfA△sigB在相同濃度膽汁酸鹽刺激下總蛋白表達圖譜的差異,找出膽汁酸鹽刺激條件下受PrfA和σB因子調(diào)控的蛋白差異點7個。 本實驗對σB因子及PrfA因子在耐受胃腸道膽汁酸鹽環(huán)境中的作用以及調(diào)控機理進行了初步研究,為后續(xù)從轉(zhuǎn)錄水平上驗證σB因子及PrfA因子在相關基因的表達過程中的作用提供了理論依據(jù)。
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【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2391006