【摘要】：機體在低氧環(huán)境下將發(fā)生一系列代償性的反應(yīng),來維持體內(nèi)氧濃度的平衡。頸動脈體(carotid body,CB)作為機體重要的外周氧感知化學(xué)感受器,當(dāng)外界氧濃度發(fā)生變化時,CB可以迅速感知機體內(nèi)氧分壓的變化,通過釋放神經(jīng)遞質(zhì),產(chǎn)生神經(jīng)沖動,繼而引起機體對低氧的應(yīng)答包括:心率增加,呼吸加深加快等生理反應(yīng),以對抗PO2的降低,使機體能在缺氧環(huán)境中得以適應(yīng)并生存。頸動脈體由I型細胞(球細胞)和II型細胞(支持細胞)組成。I型細胞起源于神經(jīng)外胚層,類似于交感神經(jīng)元,能夠釋放乙酰膽堿、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)。I型球細胞作為CB的功能細胞在機體感知低氧的過程起重要的作用。因此,頸動脈體是感知低氧刺激使機體產(chǎn)生適應(yīng)和調(diào)節(jié)的重要器官。 細胞粘附分子CHL1(close homologue of L1,CHL1)是一種跨膜蛋白,屬于粘附分子免疫球蛋白超家族成員,與神經(jīng)粘附分子L1高度同源。目前,關(guān)于細胞粘附分子CHL1的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)中的軸突生長、神經(jīng)元遷移、學(xué)習(xí)和記憶等方面。CHL1基因缺失小鼠可以正常的存活和繁殖,但在神經(jīng)突起的發(fā)育和成年后的學(xué)習(xí)和記憶方面存在一定的缺陷。我們實驗室前期的研究顯示CHL1缺失可通過激活ERK信號通路調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞的增殖,CHL1是神經(jīng)干細胞增殖的負調(diào)控因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)CHL1基因缺失小鼠給予嚴(yán)重的低氧處理后,該基因敲除小鼠較野生型小鼠的存活率和存活時間都明顯延長,表明CHL1基因缺失小鼠具有明顯的抗缺氧損傷能力。那么,CHL1基因缺失是如何提高小鼠抗急性缺氧的能力?作為在急性缺氧時具有重要調(diào)節(jié)作用的頸動脈體是否參與了此調(diào)節(jié)過程?CHL1的缺失又是如何調(diào)節(jié)頸動脈體的結(jié)構(gòu)和功能?就這些問題,我們進行了研究。主要研究結(jié)果如下: 一、CHL1基因敲除小鼠的抗低氧特性 將雄性CHL1基因敲除小鼠和野生型小鼠放置低氧艙內(nèi)進行急性低氧(O2濃度5%),觀察小鼠的存活率和存活時間。結(jié)果顯示:400s內(nèi)CHL1基因敲除小鼠的存活率為60%,明顯高于野生對照組10%的存活率。統(tǒng)計結(jié)果表明CHL1基因敲除小鼠的存活率和存活時間較野生型小鼠明顯增加。該結(jié)果提示CHL1基因缺失可以明顯提高小鼠對低氧的耐受能力。 二、CHL1在頸動脈體中的表達和定位 頸動脈體中主要含有酪氨酸羥化酶(TH)免疫反應(yīng)陽性的球細胞和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)或巢蛋白(Nestin)免疫反應(yīng)陽性的支持細胞。其中I型球細胞成簇分布,II型支持/過渡態(tài)細胞分布于球細胞周圍。通過對頸動脈體組織和體外分離培養(yǎng)的CB細胞進行免疫熒光染色,檢測CHL1在頸動脈體中的表達分布和共定位情況。結(jié)果顯示: 1. CHL1在頸動脈體中有廣泛的表達,主要定位于TH~+球細胞的胞膜和周圍支持細胞的胞膜、胞漿中。CHL1與TH~+的細胞,及GFAP/Nestin~+細胞都有共定位。因而,CHL1在頸動脈體的兩種不同的功能細胞中均有表達,提示其可能在低氧對頸動脈體的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。 2.分離的原代頸動脈體細胞中,主要的細胞類型可分為TH~+的球細胞和GFAP/Nestin~+的支持細胞。CHL1在0d時主要在TH~+的胞漿中分布,3d時CHL1主要集中在TH~+的胞漿、胞核中。而在0d和3d培養(yǎng)的GFAP~+細胞中,CHL1主要在胞漿中。因此,CHL1在兩種類型的細胞中均有表達,但表達分布有所不同。 三、CHL1基因缺失對小鼠頸動脈體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 為了探討CHL1基因敲除小鼠對低氧耐受性增強的原因,我們進一步觀察了CHL1的缺失對小鼠頸動脈體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響。 1.分離CHL1基因敲除小鼠和野生型小鼠的頸動脈體進行免疫熒光或組化染色。結(jié)果顯示:CHL1缺失后頸動脈體細胞總數(shù)增加,TH~+細胞的總數(shù)目較野生型明顯增多。提示CHL1基因缺失導(dǎo)致頸動脈體體積增大,TH~+細胞數(shù)目增加。 2.我們利用Western Blot方法從蛋白表達水平進行了進一步驗證。野生型小鼠頸動脈體中,可以檢測到165KD和185KD的CHL1蛋白條帶,CHL1基因缺失小鼠CB中不能檢測到CHL1的表達。在CHL1基因敲除小鼠頸動脈體中,作為球細胞標(biāo)志性蛋白的TH表達量明顯高于野生型小鼠;而GFAP和Nestin表達量無明顯差異。 四、CHL1基因缺失對頸動脈體功能的影響 為了研究CHL1缺失是否影響頸動脈體的功能,我們觀察了野生型和CHL1基因敲除小鼠在急性缺氧時呼吸頻率和肺通氣量的變化,以及缺氧時頸動脈體竇神經(jīng)的放電的變化。 1.利用BUXCO動物肺功能儀的體描箱,同時記錄了野生型和CHL1基因敲除小鼠在急性缺氧時的呼吸頻率和肺通氣量,結(jié)果顯示:在正常條件下CHL1基因敲除和野生型小鼠的呼吸頻率沒有明顯區(qū)別,但急性缺氧后CHL1基因敲除小鼠的肺通氣量和呼吸頻率較野生型明顯增加。 2.頸動脈體的感覺傳入神經(jīng)為竇神經(jīng),通過其傳入神經(jīng)竇神經(jīng)的放電頻率的變化向中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行信息傳遞。為了進一步證明CHL1基因敲除小鼠抗缺氧能力與頸動脈體的直接關(guān)系,我們記錄了CHL1基因敲除小鼠缺氧時頸動脈體竇神經(jīng)放電的變化。低氧刺激后CHL1基因敲除小鼠CSN放電的頻率較野生型小鼠明顯增強。 五、急性低氧對CHL1在其它組織表達的影響 為了闡明CHL1缺失小鼠的抗缺氧作用,我們還檢測了CHL1在其它重要器官如心臟、肺、腎和腦等組織中的表達,及低氧后的影響。我們對野生型小鼠進行8%氧濃度低氧處理8h,提取小鼠不同部位的蛋白進行Western blot檢測,結(jié)果如下: 1.急性低氧后CHL1在大腦皮層、腦干和下丘腦部位的表達明顯低于常氧組,而小腦部位CHL1的表達明顯增加,海馬和丘腦部位CHL1表達變化不明顯。 2.研究發(fā)現(xiàn)CHL1在心臟、肺、腎等組織中也有較高的表達,急性低氧后CHL1蛋白在心、肺組織中的表達較常氧組明顯降低,在腎組織中的表達沒有明顯改變。CHL1在心肺腎等組織中的表達提示可能參與了抗低氧作用的調(diào)節(jié),然而其作用尚待進一步的研究。 綜上所述,該研究首次探討了CHL1在低氧損傷過程中對頸動脈體的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)CHL1基因敲除小鼠的低氧耐受能力明顯增強,可能通過調(diào)節(jié)頸動脈體TH~+細胞數(shù)目,使傳入神經(jīng)竇神經(jīng)的放電頻率增加,進而提高機體對急性缺氧時呼吸反應(yīng)而改變肺通氣密切相關(guān)。CHL1在其它重要器官如心臟、肺、腎和腦等組織中的表達,及低氧后的變化,提示有可能參與了CHL1基因敲除小鼠抗缺氧的調(diào)節(jié),尚有待于進一步的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：2387651