【摘要】：老年性聾也稱年齡相關(guān)性聽力損失（ARHL），是指因年齡的增長,聽覺器官隨同身體其他組織器官一起所發(fā)生的緩慢進行性聽覺系統(tǒng)老化過程,并出現(xiàn)聽力減退的生理現(xiàn)象，屬于多基因疾病范疇，，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著世界人口老齡化趨勢的不斷加劇，老年性聾的發(fā)病率逐年增高。據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：到2025年，老年人口比例迅速增加，全世界60歲以上的人口將達12億之多，而其中65~75歲的人老年性聾的發(fā)病率為70%~80%。老年性聾的發(fā)生和發(fā)展嚴重影響老年患者的生活質(zhì)量。隨著老年性聾發(fā)病機制研究的日益深入，Welsh在Schuknecht對老年性聾分類的基礎(chǔ)上又提出了中樞性老年性聾這一概念,是指各級中樞尤其是大腦初級聽皮層神經(jīng)元凋亡及退行性變是老年性聾的主要發(fā)病機制。近年來，為了挽救老年性聾患者的聽力，嘗試了干細胞移植、藥理學(xué)干預(yù)療法及基因治療等多種方法，而干細胞移植治療是目前具有極大潛在臨床應(yīng)用價值的治療方法。 Kesser等人不僅使移植到耳蝸的神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)分化為毛細胞或螺旋神經(jīng)節(jié)細胞來替代甚至修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生凋亡和退行性變的細胞，而且提出種子細胞是通過釋放GDNF和BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子來發(fā)揮作用，提示了神經(jīng)干細胞在老年性聾等神經(jīng)退行性疾病干細胞移植治療中發(fā)揮了重要作用。目前用于老年性聾移植的細胞主要來源于胚胎期的紋狀體、海馬、腦皮層、側(cè)腦室的腦室區(qū)，但人胚胎組織和人胚胎干細胞的使用始終存在倫理學(xué)限制而來源不足，并且異體移植或多或少會存在免疫排斥問題。脂肪源性干細胞(Adipose derived stem cells, ADSCs)可在一定程度上克服上述缺點因此被認為是理想的種子細胞來源。ADSCs可以通過自體取材獲得，且具有分離培養(yǎng)較為容易，排斥反應(yīng)較弱，無致瘤性等特點,已成為一種極有潛力的成體干細胞。 針對老年性聾外周神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞移植治療雖能證實種子細胞可替代丟失的細胞，但移植動物的聽功能恢復(fù)情況尚不明確。基于目前大量研究表明老年性聾的發(fā)生是外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)合降低衰變的結(jié)果，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡和退行性變?yōu)橹�。本研究將ADSCs在特定生長因子的作用下誘導(dǎo)分化為NSCs后移植到老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠初級聽皮層，觀察此方法對ADSCs向NSCs誘導(dǎo)分化的影響。應(yīng)用透射電鏡技術(shù)、HE染色法和Tunel-POD法比較年輕組（2月齡）和老年組(10月齡)小鼠干細胞治療前初級聽皮層形態(tài)學(xué)差異及治療前后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率的變化。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組織熒光技術(shù)檢測移植的種子細胞在受體組織中的存活、遷移和分化程度，并進一步檢測了小鼠聽功能恢復(fù)情況。本研究分為三個部分： 第一部分C57BL/6J小鼠脂肪源性干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 【目的】嚴格無菌條件下分離得到C57BL/6J小鼠附睪脂肪墊組織，進行ADSCs體外培養(yǎng)和鑒定，探索新的干細胞移植治療來源。 【方法】選取體重約15g~16g的C57BL/6J小鼠，切開腹部皮膚后獲取附睪脂肪墊組織，I型膠原酶消化法分離、貼壁培養(yǎng)得到ADSCs，胰蛋白酶消化法傳代擴增。傳至第三代的ADSCs分別行流式細胞學(xué)檢測細胞表型(CD45, CD90, CD105)及免疫熒光技術(shù)檢測其特異性標(biāo)志物纖連蛋白(fibronectin)。 【結(jié)果】附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)能夠得到大量長梭形ADSCs，經(jīng)傳代后仍具有較強的增殖能力；細胞表面標(biāo)志物CD90、CD105表達強陽性，CD45表達陰性；經(jīng)fibronectin鑒定為ADSCs。 【結(jié)論】附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)可獲得大量ADSCs，易于傳代擴增，可作為新的干細胞移植治療的種子來源。 第二部分脂肪源性干細胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細胞的體外研究 【目的】探討誘導(dǎo)ADSCs分化為NSCs的體外培養(yǎng)方法，為細胞移植修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變提供種子細胞。 【方法】貼壁培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠(附睪脂肪墊)ADSCs，進行流式細胞術(shù)表型鑒定及標(biāo)志物fibronectin鑒定后，在堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成NSCs。用免疫熒光技術(shù)進行NSCs特異性標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)、增殖能力5’-溴尿嘧啶(BrdU)及多向分化潛能檢測。 【結(jié)果】誘導(dǎo)后的干細胞球經(jīng)Nestin及Brdu鑒定為NSCs，且具有較強的增殖能力；NSCs在體外分化后產(chǎn)生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽性的神經(jīng)元以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星形膠質(zhì)細胞。 【結(jié)論】ADSCs可在特定生長因子作用下被成功誘導(dǎo)為NSCs，為細胞移植修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變奠定了基礎(chǔ)。 第三部分脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療老年性聾的體內(nèi)研究 【目的】脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠后，種子細胞在體內(nèi)的存活、遷移及分化情況及對C57BL/6J小鼠聽覺功能的影響。 【方法】ADSCs誘導(dǎo)而來的NSCs立體定向注射入年輕組和老年組C57BL/6J小鼠初級聽皮層，注射后從免疫熒光化學(xué)、病理學(xué)、電生理學(xué)方面分別檢測ADSCs誘導(dǎo)而來的NSCs在體內(nèi)的存活及分化情況、注射前及注射后2w、3w、4w，Tunel-POD法檢測初級聽皮層神經(jīng)元凋亡情況、聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測小鼠聽功能變化. 【結(jié)果】C57BL/6J小鼠進行脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療后2w、3w種子細胞可在體內(nèi)存活并分化為β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽性的神經(jīng)元，但是第3w以后存活細胞數(shù)量逐漸減少，至第四周時已基本檢測不到移植細胞；老年組治療后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率較治療前明顯減少、治療后2w、3w聽功能較治療前有較明顯提高，但治療3w后聽力提高差異不大甚至有所下降至第4w時已無差異；年輕組小鼠治療前后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率及聽功能較治療前無顯著差異。 【結(jié)論】脂肪源性神經(jīng)干細胞通過在體內(nèi)分化以替代和修復(fù)老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠初級聽皮層凋亡神經(jīng)元而促進老年性聾小鼠聽功能恢復(fù)。本研究探索了一種新的老年性聾干細胞移植治療方法。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 佟雷;季麗莉;解大龍;高海;佟曉杰;;堿性成纖維生長因子和神經(jīng)生長因子聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)成年大鼠海馬神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元樣細胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年01期

2 王偉;撒亞蓮;嚴新民;;脂肪源性干細胞的定向分化潛能及臨床應(yīng)用前景[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2011年02期

本文編號：2385227