【摘要】：研究背景 肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)是由磷脂和蛋白質(zhì)組成的一種具有高度表面活性的復(fù)合物,磷脂含量為85%-90%,蛋白質(zhì)含量為8%-10%。存在于被覆肺泡表面的液體中,其結(jié)合的特異性蛋白為肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白,共有4種,小分子疏水性肺表面活性蛋白B與C,分子量分別為6-8KD和3-5KD,大分子親水性肺表面活性蛋白A與D,分子量分別為28-36KD及43KD。 人類肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因全長2.4kb,定位于第8號染色體短臂,5個內(nèi)含子和6個外顯子,僅表達于肺泡II型上皮細胞。SP-C基因最初可編碼產(chǎn)生含191～197個氨基酸、分子量為21KD的蛋白質(zhì)初級產(chǎn)物SP-C蛋白前體。非成熟的SP-C蛋白前體需經(jīng)過多步復(fù)雜的酶解過程才能分化為成熟并具有生理活性的小分子疏水性蛋白SP-C,具有促進磷脂在肺泡表面形成穩(wěn)定的單分子層,從而降低肺泡表面張力、防止呼氣末肺泡塌陷、增加肺順應(yīng)性、促進肺間質(zhì)液體回流及參與肺器官局部防御體系等重要的生理功能。 肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(surfactant associated protein A,SP-A)SP-A基因定位于10號染色體長臂q21-q24,核苷酸長度約為4.5Kb,包含兩個功能基因SP-A1、SP-A2和一個假基因。SP-A由兩種基因編碼：SP-A1和SP-A2,94%的核苷酸序列和96%的氨基酸序列相同.SP-A基因最初可編碼產(chǎn)生含248-263個氨基酸.SP-A單體是一種糖蛋白,相對分子量為26-38KD,由II型肺泡上皮細胞和Clara細胞合成和分泌。天然的SP-A由6個SP-A組成并形成一個“花束狀”結(jié)構(gòu)。其作用包括以下幾個方面①參與肺泡表面活性膜的形成和代謝,與小分子肺表面活性物質(zhì)蛋白B協(xié)同,促進表面活性物質(zhì)板層體轉(zhuǎn)化為管髓體結(jié)構(gòu),繼而參與小分子疏水性肺表面活性物質(zhì)蛋白B與C擴展管髓體為磷脂單分子層的作用；②通過受體介導(dǎo),增加肺泡II型上皮細胞攝取脂質(zhì),抑制磷脂分泌,穩(wěn)定細胞內(nèi)外肺表面活性物質(zhì)水平,保證肺泡肺表面活性物質(zhì)含量適當(dāng)；③肺表面活性蛋白A增加肺泡II型上皮細胞抗氧化能力；④肺表面活性蛋白A與D參與細胞免疫,對免疫細胞(尤其是單核巨噬細胞、中性粒細胞)具有趨化和調(diào)理吞噬作用；⑤肺表面活性蛋白A與D調(diào)節(jié)炎性及過敏反應(yīng),抑制T細胞增生,減輕肺過敏性反應(yīng)或其它毒性物質(zhì)在肺部的變態(tài)反應(yīng)。 胎肺從24周開始有肺表面活性物質(zhì)蛋白分泌,32-34周達到高峰,SP-A是最先被發(fā)現(xiàn)且在肺泡II型上皮細胞中表達最強烈、信號最豐富的蛋白,約占SP總量的50%,與肺成熟度密切相關(guān)。SP-A與新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、成人呼吸窘迫綜合征、肺炎、哮喘、肺泡蛋白沉積癥(PAP)、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)、結(jié)節(jié)病、肺腺癌、系統(tǒng)性硬化等的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。SFTPC基因表達異常可致SP-C蛋白含量、結(jié)構(gòu)變化和功能喪失進而導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的肺間前j質(zhì)性疾病、嬰幼兒肺間質(zhì)性疾病如類肉瘤病、彌漫性肺部疾病及部分成人家族性肺纖維化,最后導(dǎo)致呼吸衰竭,這些已經(jīng)被實驗和臨床研究所證實。因此尋找一種簡便、高效的方法檢測SP的含量對于預(yù)測與之相關(guān)的疾病臨床意義重大。 目前許多評估肺成熟的方法大部分是以PS為分析對象的。大體可分為生物化學(xué)方法和生物物理學(xué)方法兩類。生物化學(xué)方法是定量分析一種或幾種表面活性物質(zhì)成分的絕對量或相對量,包括卵磷脂／鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定、飽和卵磷脂測定等；生物物理學(xué)方法是通過評價羊水或痰液中肺表面活性物質(zhì)成分的肺表面活性或物理效應(yīng)來判斷肺成熟度,包括泡沫振蕩實驗、熒光偏振評價FLM、分光光度計、LB計數(shù)等；卵磷脂／鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定生物化學(xué)方法操作復(fù)雜,需時長,容易受羊水血性污染的影響,使用受到一定的限制。生物物理學(xué)方法除泡沫振蕩實驗(主觀性太強)外,其他均需要特定的儀器設(shè)備,且在羊水受到血液或陰道分泌物污染時,準(zhǔn)確率差；由于以上方法的不同缺陷,故目前建立一種非常簡便、準(zhǔn)確,可被大家廣泛接受并應(yīng)用的肺成熟度檢測方法,仍是探索的熱點。 SP-A含量的檢測對于上述多種疾病的診斷和預(yù)后具有很大的價值。杜風(fēng)蘭等研究臍血SP-A水平與羊水SP-A水平的相關(guān)性,證明臍血可以代替羊水SP-A中水平作為胎肺成熟度的標(biāo)志,利用westernblot方法,得到斑點雜交結(jié)果后用凝膠圖象分析系統(tǒng)測定NC膜上各點的相對灰度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對灰度值曲線,求得待測標(biāo)本SP-A的實際含量,尚無法達到精確測定的標(biāo)準(zhǔn)。Yoshio Kuroki等利用雙抗體夾心ELISA檢測樣本中SP-A,檢測范圍10～1280ng。此后,以SP-A單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗體夾心ELISA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于SP-A的檢測,在SP-A的研究中發(fā)揮了重要的作用。Koji Kaneko等人通過檢測24h內(nèi)新生兒臍帶血及外周血中SP-A含量預(yù)測新生兒呼吸窘迫綜合癥的發(fā)生,確定SP-A是預(yù)測胎兒肺成熟度的重要標(biāo)志。對于肺表面活性物質(zhì)蛋白SP-C來說,目前主要的檢測方法為通過基因檢測的方法了解其基因突變位點,從而確定診斷。多數(shù)SFTPC基因突變患者存在其SP-C蛋白表達量異常,由于基因診斷價格昂貴,而且耗時較長,可通過檢測SP-C蛋白有無變化進行篩查,從而提高預(yù)測肺間質(zhì)性疾病的效率。 目前國內(nèi)市場尚無自研的肺表面活性物質(zhì)蛋白含量檢測試劑盒,而進口試‘劑盒價格昂貴,不宜推廣使用。故研制定量檢測肺表面活性物質(zhì)試劑盒意義重大。而提取SP-A、SP-C蛋白是研制檢測試劑盒的關(guān)鍵一步,本實驗室曾采用maltosyl-agarose柱層析法從人肺支氣管腫泡灌洗液(BALF)中提取出高純度、高活性、結(jié)構(gòu)正正常的SP-A,2個成人尸肺中提取的SP-A含量約40mg。但該方法步驟繁瑣,產(chǎn)量少,更重要是尸體肺來源困難,用這種方法提取蛋白作為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品來源不現(xiàn)實。SP-C分子量小,體內(nèi)含量比SP-A更低,提取更困難。故利用基因工程方法合成目的蛋白后,將其作為抗原免疫動物,同時作為制備試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品是最佳的選擇。 本實驗室用人尸肺提取的SP-A蛋白作為抗原,免疫BABL/c小鼠,提取脾細胞后與骨髓瘤細胞融合,經(jīng)過篩選抗體后建立了SP-A單克隆細胞株,并能分泌高效價有活性的SP-A單克隆抗體,為研制SP-A檢測試劑盒做好了準(zhǔn)備(但試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品來源仍有困難)。故本課題擬用原核生物大腸桿菌表達SPA和SPC目的蛋白,具體研究內(nèi)容包括以下幾個步驟：RT-PCR獲取目的基因、T-A克隆、PET-28a/SP-C及PET-28a/SP-A重組質(zhì)粒的構(gòu)建、SP-C、SP-A重組蛋白的原核表達及純化、鑒定、目的蛋白的抗原性檢測。 目的：通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因SFTPA,SFTPC.進行TA克隆,克隆PCR產(chǎn)物,提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。 方法：提取肺組織總RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng),2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用PMD-18T載體反應(yīng)試劑盒,連接純化的目的DNA與PMD18T載體,并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH5a,在含有X-Gal、IPTG.Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落。計數(shù)白色、藍色菌落。 結(jié)果：成功提取到肺組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測可見28s和18s兩條條帶亮度清晰,紫外分光光度計分析A260/A280為1.923,獲得的目的基因2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與其分子量相符；經(jīng)Amp抗性和藍白顯色篩選,見培養(yǎng)板上長出藍白斑比例約為16：1,總菌落數(shù)約32個。挑取白色單菌落接種擴增后提取質(zhì)粒。經(jīng)序列測定后,以BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切,回收并純化。 結(jié)論：通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)成功獲得SFTPA,SFTPC目的基因。通過TA克隆的方法,可以成功克隆PCR產(chǎn)物。 目的：構(gòu)建PET-28a/SP-C,PET-28a/SP-A重組質(zhì)粒。 方法：將表達質(zhì)粒PET-28a及目的基因SP-A、SP-C進行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切,過夜連接,連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21感受態(tài)菌中,加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h,取50μL涂板(含Kana)后,37。C過夜培養(yǎng)。用無菌牙簽挑取單菌落于5mL含50μg/lAmp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h,再行質(zhì)粒提取與雙酶切鑒定,鑒定為陽性重組質(zhì)粒送基因公司測序。 結(jié)果：將重組質(zhì)粒送至基因公司測序,與genebank上公布的人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白基因序列一致,重組質(zhì)粒命名為PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A。 結(jié)論：將SP-C及SP-A基因成功克隆到表達質(zhì)粒PET-28a中 目的：利用重組質(zhì)粒表達SP-C及SP-A目的基因,合成目的蛋白SP-C及SP-A 方法：分別將質(zhì)粒PET28a與pET28a-SP-A/C轉(zhuǎn)化至E.coli M15[pREP4]中,37℃培養(yǎng)過夜。次日以5%轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)2h后,取3ml菌液,測光吸收值A(chǔ)600；加入IPTG誘導(dǎo)1～5h后,分別收集菌體。表達產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。利用Ni-NTA Slurry (agrose)方法進行純化,取純化后的蛋白收集物進行western blot鑒定。 結(jié)果：western blot結(jié)果顯示SP-C、SP-A重組蛋白均為單一印跡,無降解條帶。 結(jié)論：PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A在BL21中得到可溶性表達,且目的蛋白在表達過程中無降解。成功構(gòu)建了肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C/A的原核表達載體,并表達了目的蛋白SP-C/SP-A。利用Ni-NTA Slurry (agrose)方法進行純化得到的蛋白純度高。 方法：將目的蛋白SP-A及SP-C分別與佐劑混合后免疫健康的清潔級BALB/c小鼠各8只。檢測陽性血清不同稀釋倍數(shù)的抗體效價。 結(jié)果：陰性對照組、不同稀釋倍數(shù)組采用單因素方差分析,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(SP-C：F=271.417,P=0.000,SP-A：F=218.345,P=0.000),兩兩比較各稀釋倍數(shù)組均與陰性對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001)。 結(jié)論：ELISA檢測顯示SP-A及SP-C免疫動物的陽性血清OD值大于陰性血清的2.1倍,具有良好的抗原性。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李秋平,杜江,樊慧珍,封志純;maltosyl-agarose親和層析法提取人肺灌洗液中肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A及其鑒定[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2005年09期

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本文編號：2379573