【摘要】：研究背景 供體短缺是全球性難題,根據(jù)中國紅十字會的數(shù)據(jù)顯示,在美國供受體的比例為1：5,在英國為1：3,在中國則為1：150。器官短缺使得“擴大標(biāo)準(zhǔn)”的器官,或曾被認(rèn)為不適合用于移植的器官的使用率大大增加。提高邊緣性供肝(特別是中重度脂肪供肝)的利用率被認(rèn)為在某種程度上可以緩解供肝短缺。 但是脂肪肝對缺血再灌注損傷異常敏感,在移植過程中遭受的缺血再灌注損傷和免疫損傷可導(dǎo)致移植肝的原發(fā)性無功能或早期功能不良。如何預(yù)防和減少IRI是肝臟外科特別是肝移植的研究熱點之一。由于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有趨化遷移和組織修復(fù)再生等能力,從而廣泛應(yīng)用于各種抗炎性損傷和組織損傷修復(fù)等領(lǐng)域中。本研究即探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠脂肪供肝肝移植中的保護作用和其相關(guān)的機制,為提高邊緣性供肝的利用率提供一種新的方法。 第一部分 大鼠脂肪肝模型的建立目的 通過喂養(yǎng)高脂飼料建立大鼠中重度脂肪肝模型。方法 雄性Sprague Dawley (SD)大鼠20只,體重40-50g。20只大鼠隨機分為普通飼料組和高脂飼料組(各10只),兩組脂肪供能比為18.23%和48.32%。每天自由飲水和進食,每周稱大鼠體重1次,并觀察其毛色、食欲、行動、糞便及對外界的反應(yīng)情況。持續(xù)喂養(yǎng)8周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,然后處死動物,稱取肝臟濕重,計算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)。留取血清標(biāo)本行血清學(xué)指標(biāo)的檢測,肝臟病理檢查以評估大鼠脂肪肝的程度。結(jié)果 1.高脂飼料組大鼠體重和肝指數(shù)顯著高于普通飼料組。 2.高脂飼料組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和總膽固醇(total cholesterol, TC)水平較普通飼料組明顯升高,提示高脂飲食對大鼠肝細(xì)胞有一定的破壞作用并造成脂質(zhì)代謝紊亂。 3.HE染色光鏡下觀察高脂飼料組則出現(xiàn)彌漫性脂肪變性,肝細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞空泡、氣球樣變明顯,且小葉內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)論 根據(jù)血清學(xué)指標(biāo)和病理檢測結(jié)果,高脂飼料的大鼠的肝臟已經(jīng)達(dá)到中、重度脂肪肝的水平,符合下一步實驗的要求,建模成功。 第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護 作用 目的 成功分離和擴增人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,并研究其在大鼠中重度脂肪肝缺血再灌注損傷中的作用。 方法 采用Ⅰ型膠原酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化Wharton's Jelly組織的方法分離提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,用LG-DMEM和MesenPro等比例混合培養(yǎng)基的體系對huc-MSCs進行擴增。通過高脂飲食建立SD大鼠中重度脂肪肝模型。60只大鼠分為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞處理組(MSC組)和對照組,各30只。MSC組缺血再灌注術(shù)前1天和術(shù)后第3天分別從尾靜脈注射含2×106人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的PBS1.5m1。對照組則在相同時間點單純注射PBS1.5m1。術(shù)后第1、4和7天(每個時間點10只),檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝組織中超氧化物歧化酶活性(superoxidedismutase, SOD)、丙二醛(1nalondialdehyde, MDA)、腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的變化。肝組織病理切片HE染色觀察肝組織損傷和白細(xì)胞浸潤情況。 結(jié)果 術(shù)后第1、4天,與對照組相比,MSC組血清ALT、AST、TNF-α和肝組織MDA明顯降低,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。術(shù)后第七天,兩組ALT、AST和TNF-α已無明顯差異(P0.05)。而SOD在術(shù)后各時間點兩組間的比較均無明顯差異。肝組織病理檢測則發(fā)現(xiàn)MSC組肝細(xì)胞壞死和白細(xì)胞浸潤明顯較對照組減輕。 結(jié)論 1.我們成功建立了高效的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離擴增方法。 2.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注能有效減輕大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷,有望成為臨床肝臟外科和肝移植減輕脂肪肝缺血再灌注損傷的一種新方法。 第三部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠脂肪供肝保護作用的機制研究 目的 探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, huc-MSCs)對中重度脂肪供肝肝移植的保護作用,分析其可能的保護機制,為提高邊緣性供肝的利用率提供新的手段。 方法 1.實驗動物隨機分為4組：①正常肝組(n=4),普通飼料喂養(yǎng)8周的Lewis大鼠；②脂肪肝組(n=4),高脂飼料喂養(yǎng)8周的Lewis大鼠；③MSCs組(n=16),脂肪肝肝移植術(shù)后從陰莖背靜脈靜注含2×106huc-MSCs的PBS1.5ml；④對照組(n=16)：脂肪肝肝移植術(shù)后從陰莖背靜脈單純靜注含PBS1.5ml。 2.對照組和MSCs組分別于術(shù)后1d、3d各取4只大鼠,留取血清和肝臟標(biāo)本,兩組各剩余的8只大鼠觀察術(shù)后生存情況。各組留取肝組織標(biāo)本行MicroRNA (MiRNA)芯片分析。 結(jié)果 1.術(shù)后第1、3天,與對照組相比,MSCs組血清ALT、TBIL、TNF-α和肝組織MDA明顯降低,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而SOD在術(shù)后各時間點兩組間的比較均無明顯差異。 2.肝組織病理檢測則發(fā)現(xiàn)MSCs組肝細(xì)胞壞死和白細(xì)胞浸潤明顯較對照組減輕。 3.對照組和MSCs術(shù)后1周的生存率分別為為12.5%和75%,兩組大鼠術(shù)后的生存率的比較有明顯的差異(P0.05)。表明通過huc-MSCs處理后,脂肪供肝的大鼠發(fā)生PNF的幾率大大降低。 4.脂肪肝臟行肝移植術(shù)后1d,miRNA譜發(fā)生了很大的變化(29個上調(diào),27個下調(diào))。相比于對照組而言,用huc-MSCs干預(yù)后的MSCs組肝移植術(shù)后1d的miRNA譜的變化則輕微了許多(上調(diào)和下調(diào)的MiRNA各有8個)。其中MSCs組和對照組一起上調(diào)的有miR-107、miR-186、miR-25、miR-16、miR-34a、miR-339-5p,而miR-291a-5p、miR-490、miR-874、miR-3568則同時下調(diào)。而在肝移植術(shù)后1d和3d,MSCs組與對照組相比,miR-375均同時上調(diào)(2.56倍和4.22倍) 結(jié)論 1. Huc-MSCs可減輕脂肪供肝肝移植術(shù)后的IRI和免疫損傷,降低移植術(shù)后PNF的發(fā)生率,有望成為一種提高中重度脂肪肝等邊緣性供肝利用率的新方法。 2.脂肪肝行肝移植術(shù)后miRNA譜發(fā)生了很大的變化,有些miRNA可能在脂肪供肝移植術(shù)后的IRI和免疫損傷過程發(fā)揮著重要作用。 3.有些miRNA在huc-MSCs保護脂肪供肝可能發(fā)揮著重要角色,如miR-21、miR-375等。這一部分尚有待下一步的功能學(xué)實驗加以驗證。
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【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R657.3;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2375421