【摘要】：第一部分microRNA-204調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化 目的：動(dòng)脈中膜鈣化是一種常見的大血管病變,它起始于血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)向成骨樣細(xì)胞分化的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程。目前調(diào)控這一過程的具體機(jī)制還不清楚。特定的microRNA可能通過表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞(osteoblast-like cells)分化。在本實(shí)驗(yàn)中,我們主要探討miR-204是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。 方法：以β-甘油磷酸鈉干預(yù)小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞,以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-204表達(dá)水平的改變,以蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)Runx2表達(dá)水平的改變。以miR-204mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞,以蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)Runx2表達(dá)水平的改變,并檢測(cè)以β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)后成骨性標(biāo)志物ALP和OC及Runx2蛋白表達(dá)水平的改變。將野生型/突變型Runx23'-UTR與miR-204mimics共轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞,以熒光素酶報(bào)告基因策略驗(yàn)證Runx2是否為(?)niR-204的直接作用靶點(diǎn)。 結(jié)果：β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下小鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生成骨樣細(xì)胞分化,其miR-204表達(dá)水平受抑制而Runx2表達(dá)水平上調(diào)。以miR-204mimics轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞能降低Runx2蛋白水平并抑制β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞分化,而以miR-204抑制劑轉(zhuǎn)染的小鼠血管平滑肌細(xì)胞能上調(diào)Runx2蛋白水平并增強(qiáng)β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞分化,提示在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中miR-204為Runx2的內(nèi)源性抑制劑。通過熒光素酶報(bào)告基因策略驗(yàn)證Runx2為miR-204的直接作用靶基因。 結(jié)論：miR-204表達(dá)水平的下調(diào),從而上調(diào)Runx2蛋白表達(dá)水平為β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化發(fā)生的始動(dòng)因素。miR-204為血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。 目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨樣細(xì)胞分化在許多血管鈣化疾病的病理過程中起關(guān)鍵作用。近期研究表明,(?)nicroRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞鈣化過程。本研究的目的在于探尋在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用的新的miRNA。 方法：從小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞抽提小RNA。經(jīng)過Poly(A)加尾并連接5端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收,連接至pcDNA3.1TOPO載體構(gòu)建小分子RNA的cDNA文庫(kù),最后進(jìn)行菌落PCR,得到陽性克隆送測(cè)序,經(jīng)生物信息學(xué)分析確定新的miRNA (miR-X),并以Northern (?)(?)記雜交驗(yàn)證。以生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-X的作用靶基因。通過轉(zhuǎn)染miR-X前體(功能獲得研究)和miR-X抑制劑(功能缺失研究)調(diào)節(jié)miR-X的表達(dá)水平。測(cè)定轉(zhuǎn)染前后血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化程度和靶基因表達(dá)水平的改變。 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)了主要表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞的新miRNA——-miR-X,并發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)水平在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中表達(dá)減少。轉(zhuǎn)染pre-miR-X能減少β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞ALP活性、骨鈣素分泌、Runx2蛋白表達(dá)和礦化水平,而轉(zhuǎn)染miR-X抑制劑能增加血管平滑肌細(xì)胞ALP活性、骨鈣素分泌和Runx2蛋白表達(dá)水平。通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)FosB為niR-X的直接作用靶基因。miR-X過表達(dá)能下調(diào)FosB蛋白表達(dá)水平,對(duì)FosBmRNA表達(dá)水平卻無影響。 結(jié)論：miR-X表達(dá)水平的下調(diào)通過作用于靶基因FosB參與調(diào)節(jié)β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程。 目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的凋亡在心血管疾病中的血管重塑方面起重要的調(diào)控作用。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體,在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。但是apelin是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞凋亡過程仍未可知。本實(shí)驗(yàn)將以人原代血管平滑肌細(xì)胞為模型,探討apelin對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用及參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。 方法：以Western免疫印跡檢測(cè)APJ在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平。以血清饑餓法誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡,以apelin重組蛋白干預(yù)細(xì)胞,以細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)法及TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。以siRNA沉默血管平滑肌細(xì)胞APJ的表達(dá)后,再檢測(cè)apelin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。以Western免疫印跡檢測(cè)apelin對(duì)Bcl-2、Bax蛋白及MAPK、Akt磷酸化水平的影響,再檢測(cè)使用相應(yīng)的信號(hào)通路阻斷劑及APJ的siRNA后信號(hào)通路的激活及細(xì)胞凋亡水平的變化。 結(jié)果：Western免疫印跡檢測(cè)出APJ在人原代血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。Apelin能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞凋亡。通過siRNA沉默APJ的表達(dá)能阻斷apelin的抗凋亡作用。apelin上調(diào)Bcl-2的表達(dá),下調(diào)Bax的表達(dá)。apelin還能激活ERK (extra-cellular signal-regulated protein kinase,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶)和Akt(磷脂酰肌醇-3-激酶下游效應(yīng)物)信號(hào)通路。APJ的siRNA能阻斷apelin誘導(dǎo)的ERK和Akt的活化水平。LY294002(磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑)能阻斷Akt的活化和apelin(?)勺抗凋亡作用。 結(jié)論：Apelin能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞凋亡,這種抗凋亡的作用是通過APJ/PI3-K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2374964