【摘要】：研究背景 器官移植是治療許多終末期疾病和惡性腫瘤等疾病的有效辦法,但是器官移植后必需應(yīng)用免疫抑制劑防止急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,免疫抑制劑通過抑制T細胞和B細胞等靶細胞的細胞增殖、細胞因子合成而起作用。自環(huán)孢素和新型免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床以來,器官移植存活率已經(jīng)有了提高,但排斥反應(yīng)依然是導(dǎo)致移植器官功能不全以至丟失的重要原囚,此外長期免疫抑制治療的副作用,如心血管疾病、機會感染、惡性腫瘤、藥物的肝腎毒性,也極大阻礙患者的長期存活。因此,建立可靠的免疫監(jiān)測方法,不僅能夠幫助醫(yī)生根據(jù)移植受者不同的免疫應(yīng)答狀態(tài)合理地調(diào)整免疫抑制方案,而且可為臨床移植免疫耐受的誘導(dǎo)提供必要條件。但是目前仍然無法區(qū)分移植抗原引起的免疫排斥反應(yīng)和病毒細菌感染引起的免疫反應(yīng)。理想的免疫抑制治療應(yīng)該在免疫抑制和保持免疫力間取得平衡,因此對于臨床醫(yī)生來說移植患者管理是一件很困難的事。保存受體免疫力,盡可能減小免疫抑制劑用量或誘導(dǎo)免疫耐受一直是移植免疫學(xué)家的主要目標(biāo),這方面雖然也取得了一些令人興奮的成果,但是誘導(dǎo)耐受仍然有大量的工作要做,研究誘導(dǎo)免疫耐受方法,盡可能減小免疫抑制的用量,研究檢測免疫耐受及免疫力的免疫學(xué)方法將是今后幾年器官移植所面臨的最重要的挑戰(zhàn)。 移植后受體的可靠的免疫狀態(tài)指標(biāo)可以為免疫抑制劑的使用提供依據(jù),使免疫抑制劑不僅可以根據(jù)排斥反應(yīng)的程度或耐受情況使用,還可以根據(jù)患者的易感性規(guī)范化用藥,由于長期免疫抑制劑治療所引起的的高發(fā)病率和高死亡率,高度期望規(guī)范化用藥能夠?qū)崿F(xiàn)。目前,人們圍繞著免疫反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及的細胞及分子,提出了一系列監(jiān)測指標(biāo),包括：細胞介導(dǎo)的淋巴淋巴細胞毒試驗(Cell-mediated lymphotoxicity),外周血中白細胞介素(interleukin, IL)2、-4、-10、 γ干擾素、TNF-α、sCD30等細胞因子的檢測,受體血內(nèi)的供體特異性抗體的檢測,T細胞對抗原非特異性多克隆刺激物反應(yīng)的檢測(T cell responses to polyclonal, non-antigen-specific stimulation),調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的監(jiān)測,血液中細胞因子的：mRNA前體分析,以及采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法尋找血液或者尿液或支氣管肺泡灌洗液中與移植排斥有關(guān)的生物標(biāo)記物,均從不同側(cè)面反映著機體的免疫水平以及對移植物的排斥情況,但是,由于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性,目前的免疫學(xué)檢測方法均有其局限性,各有其優(yōu)點和缺點,甚至有時候得出矛盾的結(jié)果,不能很好地區(qū)分出移植耐受和移植排斥反應(yīng),因此依靠單一免疫指標(biāo)來評估機體的免疫狀態(tài)不太現(xiàn)實,臨床上衡量器官移植后排斥反應(yīng)及免疫抑制治療的效能主要通過排斥反應(yīng)的發(fā)生情況(病理活檢)和移植物功能情況,如腎移植時血肌酐和尿素氮值,肝移植時肝功能情況(血氨、ALT、AST、膽紅素等)來進行評估。但是,僅根據(jù)臨床癥狀和病理活檢還是遠遠不夠的,因為臨床癥狀發(fā)生時移植物排斥已較嚴重,不適合早期診斷；而且活組織病理檢查對移植物和宿主均是一種損傷性檢查,不能反復(fù)進行。 本課題設(shè)計了一種簡單的體內(nèi)試驗方法來監(jiān)測皮膚移植后新西蘭大白兔的免疫狀態(tài),其啟發(fā)源于淋巴細胞毒性試驗在體內(nèi)的應(yīng)用,方法為用活細胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester, CFDA-SE,也簡稱為CFSE)標(biāo)記移植復(fù)合抗原供體細胞,標(biāo)記的脾細胞懸液輸注給不同的受體,輸注后不同時間點采血進行流式細胞分析。流式細胞儀檢測供體淋巴細胞在受體內(nèi)遭受排斥反應(yīng)過程,同時設(shè)置同基因受體細胞作為內(nèi)參照,消除系統(tǒng)誤差,在單細胞水平判定受體的免疫狀態(tài),以期為同種異體移植受體免疫狀態(tài)的監(jiān)測提供一種簡單有效的方法。 目的： 建立一種能檢測皮膚移植后大白兔的免疫狀態(tài)的供體抗原特異性體內(nèi)細胞毒性試驗方法,了解體內(nèi)細胞毒性實驗的抗原特異性,移植排斥模型理論上具有抗原特異性,僅對供體復(fù)合抗原有特異性排斥反應(yīng)。 方法： 建立A組：異體皮膚移植排斥模型組；D組：低劑量免疫抑制劑異體皮膚移植排斥模型組；E組：高劑量免疫抑制劑異體皮膚移植排斥模型組,分別輸將供體(雌性新西蘭大白兔)及受體(雄性新西蘭大白兔)脾臟,流式細胞檢測兩種混合細胞懸液比例變化情況,同時設(shè)置B組自體皮膚移植模型組,C組：未行皮膚移植對照組,與皮膚排斥模型組進行對比研究。以上各組皮膚移植排斥模型建立后,從以上各組中分別取雌性新西蘭大白兔(供體)及雄性新西蘭大白兔(受體)脾臟制備脾細胞單細胞懸液,分別用不同濃度CFSE染色(雌性新西蘭大白兔用高濃度6μM,雄性新西蘭大白兔用低濃度0.24μM染色)后制備1：1混合細胞懸液,混合懸液制備成功后立即注入雄性新西蘭大白兔(受體)體內(nèi),混合懸液注射后分別于1h、2h、4h、8h抽取外周血,用紅細胞裂解液將紅細胞裂解后,流式細胞儀檢測小鼠外周血兩種熒光細胞的比例變化,并計算各組雌性新西蘭大白兔(受體)脾細胞的殺傷率(按公式計算供體特異性細胞殺傷率：%specific lysis=1-donor cells/recipient cells×100%),與移植皮片狀態(tài)及常規(guī)病理檢查進行對比研究。 結(jié)果： 1、雌兔→雄兔異體移植排斥組：皮膚移植排斥模型在移植后第9天皮膚開始脫落,13.0±1.0天時移植排斥模型移植皮膚完全排斥,移植皮膚壞死。雄兔自體皮膚移植模型：移植皮膚未出現(xiàn)排斥現(xiàn)象,移植物可以長期存活。雌兔→雄兔異體移植低劑量免疫抑制劑組：可見移植皮膚在兩周左右逐漸變黑,出現(xiàn)壞死的跡象,皮膚存活時間為13.4±1.1天。雌兔→雄兔異體移植高劑量免疫抑制劑組：移植后14天可見移植皮膚存活,移植皮膚存活時間大于25天。2、各組皮膚移植病理結(jié)果示：A組(移植排斥組)與D組(免疫抑制劑低劑量組),移植皮膚均出現(xiàn)壞死,均可見皮膚結(jié)構(gòu)破壞,大量淋巴細胞浸潤；B組(自體移植耐受組)與E組(免疫抑制劑高劑量組)皮膚均存活,未出現(xiàn)移植皮膚壞死的病理表現(xiàn),可見皮膚結(jié)構(gòu)正常,無淋巴細胞浸潤。3、皮膚移植排斥模型組和低劑量免疫抑制劑組注射混合脾細胞懸液后殺傷率在8h達到高水平86.19±6.95%和88.14±4.21%,在8小時異基因供體雄兔脾細胞基本被完全清除,而其余各組殺傷率在8小時仍處于較低的水平,自體移植耐受組8小時殺傷率為31.58±3.41%,未移植組8小時殺傷率為33.51±3.49%,異體皮膚移植高劑量免疫抑制劑組8小時殺傷率為26.82±3.26%。各時間點殺傷率進行單向方差分析結(jié)果顯示：各時間點殺傷率進行單向方差分析結(jié)果顯示：各時間點間殺傷率均有顯著差異,1小時各組殺傷率有顯著差異,F=226.53,P=0.000：2小時各組殺傷率有顯著差異,F=218.37,P=0.000；4小時各組殺傷率有顯著差異,F=340.11,P=0.000；8小時各組殺傷率有顯著差異,F=240.07, P=0.000。Dunnett t(2-sided)法檢驗,各組與A組(異體移植排斥組)兩兩比較顯示：各時間點A組與B組、C組、E組之間有顯著性差異,A組與D組之間無顯著性差異。即未移植組、自體移植組、高劑量免疫抑制劑組殺傷率上升緩慢,無特異性殺傷�？梢姼鹘M殺傷率與移植皮膚狀態(tài)及病理改變一致。 結(jié)論： 體內(nèi)細胞毒性實驗是一種供體抗原特異性免疫狀態(tài)檢測方法,本實驗提供了一種特異的體內(nèi)免疫狀態(tài)監(jiān)測方法,利用一種簡單的將供體細胞及受體細胞經(jīng)過CFSE染色后輸入受體細胞體內(nèi)的方法監(jiān)測供、受體兩種細胞的比例,將試驗流式檢測設(shè)定在淋巴細胞門,兩種細胞CFSE的染色濃度差控制在25倍,輸注細胞總數(shù)在109時,能在輸注混合細胞懸液后快速準(zhǔn)確地檢測出受體的免疫狀態(tài),從而可以判斷出受體的免疫系統(tǒng)對移植物排斥反應(yīng)的強度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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