【摘要】：BCCIP是一個(gè)與BRCA2和p21相互作用的蛋白質(zhì)，BCCIP在細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA同源重組修復(fù)、基因組穩(wěn)定性等方面起著重要作用。但是BCCIP確切的作用機(jī)制并不清楚，為了進(jìn)一步探討B(tài)CCIP的功能和作用機(jī)制，本課題采用免疫共沉淀和雙酵母雜交等實(shí)驗(yàn)方法尋找鑒定與BCCIP相互作用的蛋白，并對其功能進(jìn)行初步研究。 1.在前期研究工作的基礎(chǔ)上，用Flag標(biāo)簽連接在BCCIPβ N端的外源性蛋白Flag-BCCIPβ，在HT1080細(xì)胞內(nèi)可以與內(nèi)源性的PAK1IP1蛋白免疫共沉淀，初步鑒定出PAK1IP1與BCCIPβ存在相互作用； 2.構(gòu)建了Flag標(biāo)簽連接在BCCIP C端的pOZ-FH-C1-BCCIP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后所表達(dá)的外源性蛋白BCCIPβ-Flag可以拖下內(nèi)源性的PAK1IP1蛋白，進(jìn)一步確定PAK1IP1與BCCIPβ的相互作用； 3.構(gòu)建了PAK1IP1的原核表達(dá)載體pET-28b-PAK1IP1，在原核生物大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行重組蛋白GST標(biāo)記的BCCIP與His標(biāo)記的PAK1IP1的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用GST-BCCIP可以拖下His-PAK1IP1，初步鑒定PAK1IP1與BCCIPβ的相互作用可能是直接的； 4.構(gòu)建Flag標(biāo)記的PAK1IP1全長質(zhì)粒和7個(gè)不同片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外源性PAK1IP1全長蛋白可以拖下內(nèi)源性的BCCIP蛋白，從反方向再次證明PAK1IP1與BCCIPβ發(fā)生相互作用；應(yīng)用構(gòu)建的PAK1IP1的7個(gè)不同片段蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，確定了PAK1IP1蛋白C末端的330到392氨基酸是與BCCIPβ的相互作用區(qū)域； 5.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Flag標(biāo)記的BCCIP N端1到167氨基酸片段和1到258氨基酸片段的2個(gè)細(xì)胞系，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定BCCIP蛋白N末端1到167氨基酸是與PAK1IP1的相互作用區(qū)域； 6.設(shè)計(jì)針對PAK1IP1的shRNA，連接入pSilencer5.1-U6逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞，收集病毒上清感染HT1080細(xì)胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的PAK1IP1蛋白表達(dá)下調(diào)的單克隆細(xì)胞株； 7.應(yīng)用上述細(xì)胞株進(jìn)行PAK1IP1的功能研究發(fā)現(xiàn)，PAK1IP1下調(diào)會引起HT1080細(xì)胞的生長減慢，但是不會影響B(tài)CCIP蛋白表達(dá)水平和蛋白細(xì)胞內(nèi)定位的變化；細(xì)胞照射后的γ-H2AX分析和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PAK1IP1下調(diào)并不引起HT1080細(xì)胞放射敏感性的改變； 8.應(yīng)用酵母雙雜交法篩選到3個(gè)與BCCIP相互作用的文庫質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定，與BCCIPα相互作用的文庫質(zhì)粒是增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和FAM46A，，與BCCIPβ相互作用的文庫質(zhì)粒是PCNA。其中，F(xiàn)AM46A是首次發(fā)現(xiàn)的與BCCIPα相互作用蛋白，為BCCIP功能和作用機(jī)制的研究提供了新的方向。 結(jié)論： 1.發(fā)現(xiàn)BCCIPβ新的相互作用蛋白PAK1IP1，兩蛋白間的相互作用可能是直接的；確定PAK1IP1C末端的330到392氨基酸和BCCIP N末端1到167氨基酸是兩者相互作用的區(qū)域； 2.用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的shRNA在HT1080細(xì)胞成功構(gòu)建了PAK1IP1蛋白表達(dá)下調(diào)的模型；PAK1IP1下調(diào)會引起HT1080細(xì)胞的生長減慢，但是不會影響B(tài)CCIP蛋白表達(dá)水平和蛋白細(xì)胞定位的變化，并且PAK1IP1與放射敏感性無關(guān)； 3.雙酵母雜交法鑒定出PCNA和Fam46A與BCCIP相互作用，其中，F(xiàn)AM46A是新發(fā)現(xiàn)的與BCCIPα相互作用蛋白，為BCCIP功能和作用機(jī)制的研究提供新的方向。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉曉霞;劉超英;李曉轅;宗珊;岳瑛;;BCCIP在卵巢惡性腫瘤的表達(dá)及臨床意義分析[J];中國免疫學(xué)雜志;2012年03期

本文編號：2373280