【摘要】：A組輪狀病毒(Group A Rotavirus,簡(jiǎn)稱(chēng)ARV)是引起全世界5歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的首要病原,全世界每年有超過(guò)527,000個(gè)因感染輪狀病毒而死亡的病例,且每年有近兩百萬(wàn)以上兒童因此患重病。鑒于輪狀病毒危害嚴(yán)重且無(wú)有效治療手段,世界衛(wèi)生組織一直將發(fā)展輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)發(fā)展疫苗項(xiàng)目之一。 接種RV疫苗被認(rèn)為是減少重癥RV感染、發(fā)病和死亡的最好方法,目前公認(rèn)的最佳免疫方式為口服免疫。腺病毒載體是目前基因治療和重組疫苗中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一。由于腺病毒能在呼吸道和腸道內(nèi)繁殖,所以能誘導(dǎo)全身免疫并產(chǎn)生局部粘膜免疫。另外,腺病毒安全可靠,可以通過(guò)口服或滴鼻給藥,不產(chǎn)生熱源及其它副作用,適于嬰幼兒使用。我們課題組前期以腺病毒為載體表達(dá)輪狀病毒保護(hù)性抗原,對(duì)輪狀病毒基因工程疫苗做了很多系統(tǒng)性的研究工作。我們研究表明,以Ad5為載體,表達(dá)輪狀病毒VP6基因的重組腺病毒在滴鼻的免疫方式上,取得了比較好的免疫和保護(hù)效果。腸腺病毒HAdV-41是天然的人胃腸道病原,是潛在的口服給藥基因轉(zhuǎn)移載體和靶向治療胃腸道載體,已有使用HAdV-41作為疫苗載體的相關(guān)報(bào)道。我們課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建了新型的E1區(qū)缺失的重組Ad41載體系統(tǒng)和能夠促進(jìn)HAdV-41在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞系293TE7,體外檢測(cè)顯示Ad41對(duì)酸的耐受情況好于Ad5。另外,口服給藥是最簡(jiǎn)單的給藥方式,與腹瀉病毒天然的侵入方式相同,又有同時(shí)激活系統(tǒng)免疫和粘膜免疫的作用。因此,以Ad41為載體,探討口服免疫重組輪狀病毒疫苗的免疫保護(hù)作用具有重要的意義。 基于前期的研究成果,在本研究中,我們利用反向遺傳學(xué)的方法成功構(gòu)建了HAdV-41感染性克隆pKAd41,建立了293TE7-HAdV-41系統(tǒng),為進(jìn)一步開(kāi)展HAdV-41的生物學(xué)研究打下了基礎(chǔ),為促進(jìn)Ad41作為口服疫苗載體的研究打下基礎(chǔ)。本研究還成功制備了以Ad41為載體,穩(wěn)定表達(dá)人輪狀病毒VP6基因的非復(fù)制型重組腺病毒rvAd41-VP6(o),口服免疫小鼠結(jié)果證實(shí),腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體,比Ad5更適合用于為腹瀉病毒的疫苗研制,為Ad41作為口服疫苗載體的應(yīng)用提供了有利證據(jù)。 一、人腺病毒41型感染性克隆的成功構(gòu)建 目的：構(gòu)建人腺病毒41型感染性克隆,以便進(jìn)一步研究HAdV-41并改良Ad41載體系統(tǒng)。方法和結(jié)果：首先,我們用BglⅡ酶切攜帶GFP基因的重組腺病毒質(zhì)粒pAd41-GFP,回收含有Kan-pBR322Ori和HAdV-41基因組左、右末端的片段,與野生型HAdV-41基因組DNA共電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株發(fā)生同源重組,經(jīng)Kan抗性篩選得到HAdV-41感染性克隆pKAd41,該克隆轉(zhuǎn)染293TE7細(xì)胞成功拯救出野生型HAdV-41病毒；通過(guò)酶切和測(cè)序等方法鑒定拯救的HAdV-41病毒成功整合了穩(wěn)定的基因組DNA；用Western blot技術(shù)驗(yàn)證了HAdV-41病毒含長(zhǎng)短Fiber為41型腺病毒；銀染實(shí)驗(yàn)從蛋白水平證實(shí)HAdV-41具有比較完整的病毒蛋白組分；分別用HAdV-41病毒感染293TE7和293細(xì)胞,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hexon蛋白在293TE7細(xì)胞中的表達(dá)更強(qiáng)；HAdV-41病毒在293TE7細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析表明,HAdV-41病毒在293TE7細(xì)胞中具有非細(xì)胞溶解復(fù)制特性,并且只有非常少的子代病毒釋放到培養(yǎng)上清中；我們分別以不同MOI的HAdV-41感染293TE7細(xì)胞,觀察細(xì)胞在感染病毒后連續(xù)1～13d的變化,結(jié)果證實(shí)病毒感染細(xì)胞后在長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)制增殖過(guò)程中不會(huì)有噬斑的出現(xiàn)。結(jié)論：本部分研究成功構(gòu)建了有效的感染性克隆pKAd41,表明用pKAd41和293TE7細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)研究HAdV-41是可取的,為深入研究HAdV-41的生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ),為第二部分利用Ad41作為口服疫苗基因轉(zhuǎn)移載體的研究提供了有用信息。 二、以Ad41為載體的輪狀病毒VP6基因重組腺病毒免疫效果初探 目的：以Ad41為載體,制備和鑒定可表達(dá)A組輪狀病毒VP6基因的非復(fù)制型重組腺病毒,在小鼠模型上觀察粘膜、體液和細(xì)胞免疫效果和攻毒保護(hù)作用,探討腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體,用于腹瀉病毒的疫苗研制的可行性。方法和結(jié)果：我們首先利用本室前期構(gòu)建的重組腺病毒真核表達(dá)載體,PmeⅠ線(xiàn)性化后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293TE7細(xì)胞,包裝出重組腺病毒rvAd41-VP6(o);經(jīng)酶切和透射電子顯微鏡技術(shù)鑒定正確后,通過(guò)PCR、RT-PCR技術(shù)證實(shí)rvAd41-VP6(o)中確有特異性的VP6基因穩(wěn)定整合并轉(zhuǎn)錄,有較好的遺傳穩(wěn)定性；通過(guò)Western blot技術(shù)鑒定目的蛋白的表達(dá)和病毒型特異性,結(jié)果證實(shí)rvAd41-VP6(o)為41型腺病毒,可穩(wěn)定表達(dá)VP6蛋白；大量擴(kuò)增rvAd41-VP6(o)并經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化得到足量的重組腺病毒；用消化法和有限稀釋法檢測(cè)滴度,顆粒滴度和感染滴度分別達(dá)到了4.35×1011VP/ml和3.95×108IU/ml;一步法生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rvAd41-VP6(o)具備病毒復(fù)制生長(zhǎng)的基本特征,病毒在細(xì)胞中具有非細(xì)胞溶解特性；我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中體外檢測(cè)證實(shí)了Ad41對(duì)酸的耐受情況好于Ad5；隨后我們進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn),設(shè)rvAd41-VP6(o)、rvAd5-VP6(o)、 PBS三組分別以1×1010VP口服免疫小鼠,在同樣的免疫劑量下,三次免疫后,ELISA檢測(cè)顯示rvAd41-VP6(o)組產(chǎn)生的血清IgG抗體從陽(yáng)轉(zhuǎn)比例(100%,10/10)到抗體強(qiáng)度(OD值1.0300±0.1984)均強(qiáng)于Ad5組(30%,3/10；0.3428±0.2760),引發(fā)了更強(qiáng)的體液免疫,攻毒后對(duì)小鼠的保護(hù)作用也優(yōu)于Ad5。 rvAd41-VP6(o)組的小腸IgA抗體水平強(qiáng)于rvAd5-VP6(o),誘導(dǎo)了更強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)。但是,ELI Spot和CBA檢測(cè)細(xì)胞免疫水平?jīng)]有得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。結(jié)論：我們成功制備了以Ad4I為載體的穩(wěn)定表達(dá)VP6基因的重組腺病毒rvAd41-VP6(o),其在體外具有良好的生物學(xué)性質(zhì)；動(dòng)物免疫結(jié)果提示,腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體,比Ad5更適合用于腹瀉病毒的疫苗研制。 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了人腺病毒HAdV-41感染性克隆pKAd41,建立了293TE7-HAdV-41系統(tǒng),為進(jìn)一步開(kāi)展HAdV-41的生物學(xué)性狀和功能研究打下了基礎(chǔ)。本研究還以Ad41為載體,成功制備了穩(wěn)定表達(dá)VP6基因的重組腺病毒rvAd41-VP6(o),證實(shí)了腸腺病毒載體Ad41是適宜的腸道給藥的基因轉(zhuǎn)移載體,Ad4l作為疫苗載體比Ad5更適合用于腹瀉病毒的疫苗研制。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2371180