【摘要】：乙型肝炎(hepatitis B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的以肝實質(zhì)細胞變性、壞死為主要病變的高危害性傳染性疾病。慢性HBV感染常常會導致肝硬化、肝衰竭以及肝細胞癌的發(fā)生,嚴重威脅著人類的健康。乙型肝炎慢性化的一個主要原因是感染者缺乏有效的特異性免疫應(yīng)答,不能清除其體內(nèi)的乙肝病毒。在乙型肝炎的治療領(lǐng)域,目前采用的藥物治療多數(shù)療效并不理想,亟待研究新的治療策略。 DNA疫苗,又稱核酸疫苗或基因疫苗,是隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型疫苗,不僅具有預(yù)防疾病的作用,同時還具有治療疾病的應(yīng)用價值。諸多實驗已經(jīng)證實HBV DNA疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生抗原特異性細胞免疫及體液免疫應(yīng)答,接種后可以誘導多種實驗動物產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)及產(chǎn)生特異性抗體。但是,DNA疫苗在人體的免疫效果始終不能盡如人意。如何提高HBV DNA疫苗的免疫效果是DNA疫苗研究領(lǐng)域的熱點之一,目前采用的研究策略主要是通過聯(lián)合免疫佐劑的方法來增強DNA疫苗的免疫效果,將某些具有增強免疫應(yīng)答的分子基因、蛋白質(zhì)以及其它免疫活性分子聯(lián)合DNA疫苗注入機體以增強免疫效果,這些分子主要包括共刺激分子、趨化因子、誘導凋亡的分子、Toll樣受體及其配體等。 乙肝核心抗原(HBcAg)能夠在原核生物中穩(wěn)定表達,且保留其固有的免疫原性,是典型的T細胞非依賴性抗原和T細胞依賴性抗原,可以在小鼠模型中誘發(fā)強烈的HBcAg特異性的Th細胞反應(yīng)并產(chǎn)生抗體。近年來有關(guān)固有免疫應(yīng)答的機制的研究取得了重大的進展,TBK-1(TANK binding kinase-1)是一種TRAF (TNFR associating factor)家族相關(guān)的結(jié)合激酶,活化的TBK-1能夠誘導IRF3的磷酸化以及NF-κB激活,進而促進IFN-β的產(chǎn)生,是固有免疫應(yīng)答過程中的重要信號分子。 本研究采用以哺乳動物高表達質(zhì)粒(pcDNA3.1)為載體的HBcAg DNA疫苗,以BALB/c小鼠為實驗動物,觀察TBK-1對HBcAg DNA疫苗誘導小鼠特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答的影響。采用pcDNA3.1(+)作為載體,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcTBK-1;在體外模擬dsDNA刺激L929細胞,檢測TBK-1對其誘導產(chǎn)生IFN-β的影響；用HBcAg核酸疫苗(pcHBc)單獨或聯(lián)合質(zhì)粒pcTBK-1免疫BALB/c小鼠,分別在第0,3,6周進行免疫,在第8周檢測特異性抗體,脾臟淋巴細胞增殖,細胞因子IFN-γ及IL-4表達水平以及HBcAg特異性CTL活性等免疫學指標。結(jié)果顯示,dsDNA刺激各組L929細胞后,TBK-1轉(zhuǎn)染組與對照組相比在mRNA水平及蛋白水平均能顯著增強IFN-β的表達(P0.05)。pcHBc聯(lián)合pcTBK-1免疫小鼠的抗-HBc水平顯著增高(P0.05)；淋巴細胞在體外經(jīng)HBcAg刺激后,其增殖程度明顯高于pcHBc單獨免疫組(P0.05)；經(jīng)HBcAg刺激后的淋巴細胞培養(yǎng)上清中,聯(lián)合免疫組IFN-γ表達水平顯著增高(P0.05),而IL-4表達水平無明顯改變(P0.05)；單獨pcHBc免疫及聯(lián)合免疫的小鼠中,HBcAg特異性CTL殺傷率均高于對照組,其中聯(lián)合免疫組小鼠的CTL殺傷率顯著增高(P0.05),提示TBK-1能夠增強HBcAg核酸疫苗誘導的特異性體液免疫及細胞免疫應(yīng)答,并且主要通過Thl型免疫應(yīng)答途徑,初步闡釋了TBK-1作為分子免疫佐劑的作用機制。 綜上所述,在細胞模型中,TBK-1在dsDNA刺激作用下,能夠顯著增強下游IFN-β的表達；在小鼠模型中,TBK-1能夠增強HBcAg核酸疫苗誘導的特異性體液免疫及細胞免疫應(yīng)答,初步揭示了TBK-1作為HBV DNA疫苗佐劑的可行性。研究結(jié)果為HBV DNA疫苗的研究提供了實驗和理論依據(jù),并為慢性乙型肝炎的治療提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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