【摘要】：Runx2是成骨細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。Runx2在誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中需要依賴染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和輔助因子的參與來調(diào)控Runx2與DNA的結(jié)合和Runx2的轉(zhuǎn)錄活性的改變。例如,抑制一種組蛋白去乙�；窰DAC3的活性可以顯著增強(qiáng)骨鈣蛋白基因表達(dá)、加速礦化。 我們?cè)谇叭岁P(guān)于HDACs與Runx2的相互作用的研究成果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN的基因表達(dá)調(diào)控的影響。首先,通過熒光雙報(bào)告檢測實(shí)驗(yàn)檢測了HDAC家族成員HDAC1,3,4,5,6,7,8,10,Sirt2以及HAT家族成員P300,GCN5,CBP對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有HDAC1和HDAC3對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性有明顯抑制作用;加入HDAC抑制劑TSA后,不僅這種抑制作用消失,反而加強(qiáng)了Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性,而且顯著地抑制了HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的抑制作用。為了分辨核小體結(jié)構(gòu)是否參與HDAC1的這種抑制作用,我們把OPN啟動(dòng)子連在能產(chǎn)生核小體結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體上,并同HDAC1、Runx2轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。結(jié)果表明產(chǎn)生核小體的載體與不產(chǎn)生核小體的載體相比,HDAC1抑制Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的作用趨勢是基本相同的,而且TSA的作用效果也是基本相同的。這說明HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的影響與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有關(guān)系。 接下來,我們用免疫熒光(IF)和免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了HDAC1與Runx2共定位于細(xì)胞核中,猜測二者可能在同一復(fù)合物中。我們進(jìn)一步用CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí),HDAC1和Runx2都能結(jié)合到OPN的啟動(dòng)子上。我們通過將HDAC1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到過表達(dá)Runx2的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn),HDAC1顯著抑制了Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平,但有趣的是,HDAC1對(duì)ALP mRNA水平?jīng)]有影響。在HDAC1的酶活性被TSA抑制后,Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平明顯上升,但同時(shí)Runx2誘導(dǎo)的ALP mRNA水平不變。這些結(jié)果說明HDAC1抑制Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平的作用和HDAC1抑制Runx2激活OPN啟動(dòng)子活性的作用是一致的,并且這種作用具有一定的特異性。 我們的免疫印跡結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的第6天后,細(xì)胞中OPN的mRNA水平明顯提高,與此同時(shí)HDAC1蛋白水平減弱。不僅如此,我們還同時(shí)分析了多種不同細(xì)胞系的HDAC1蛋白水平,發(fā)現(xiàn)隨著分化程度的不斷深入,其HDAC1蛋白水平也呈逐步減弱的趨勢。以上結(jié)果表明,在Runx2上調(diào)OPN mRNA的水平甚至在Runx2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的過程中,HDAC1可能起到一種抑制性的屏障作用,當(dāng)Runx2通過了這個(gè)屏障后,HDAC1就不會(huì)再對(duì)OPN的表達(dá)起到明顯抑制作用,從而促進(jìn)Runx2的調(diào)控作用。另外,我們還發(fā)現(xiàn)HDAC1對(duì)Runx2的蛋白水平?jīng)]有影響,而Runx2的蛋白水平卻隨著分化而明顯增加,因此我們猜測在成骨細(xì)胞分化過程中,可能存在HDAC1以外的某種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制調(diào)控Runx2的蛋白質(zhì)水平,從而影響成骨細(xì)胞分化。我們的研究初步地揭示了HDAC1抑制Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平的分子機(jī)制,為人們利用HDACs來治療骨骼疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Runx2 is one of the key transcription factors in the process of osteoblast differentiation. In the process of inducing stem cells to osteoblast differentiation, Runx2 depends on the changes of chromatin structure and the participation of auxiliary factors to regulate the binding of Runx2 to DNA and Runx2. Changes in transcriptional activity. For example, inhibiting the activity of a histone deacetylase HDAC3 can significantly enhance osteocalcin gene expression and accelerate mineralization. On the basis of previous studies on the interaction between HDACs and Runx2, we further studied the effect of HDAC1 on the regulation of OPN gene expression mediated by Runx2. Firstly, the effects of HDAC family member HDAC1,3,4,5,6,7,8,10,Sirt2 and HAT family member P300GCN5CBP on OPN promoter activity mediated by Runx2 were detected by fluorescence double report assay. The results showed that only HDAC1 and HDAC3 could inhibit the activity of OPN promoter mediated by Runx2. The addition of HDAC inhibitor TSA not only decreased the inhibitory effect, but also enhanced the OPN promoter activity mediated by Runx2, and significantly inhibited the inhibition of HDAC1 on Runx2 mediated OPN promoter activity. To determine whether the nucleosome structure is involved in the inhibition of HDAC1, we attach the OPN promoter to the plasmid vector that produces the nucleosome structure and transfer it into the cell with HDAC1,Runx2. The results showed that the tendency of HDAC1 to inhibit the activity of OPN promoter mediated by Runx2 was basically the same as that of vector without nucleosome, and the effect of TSA was basically the same. This indicated that the effect of HDAC1 on Runx2 mediated OPN promoter activity was not related to chromatin structure. Then we used immunofluorescence (IF) and immunoprecipitation (Co-IP) experiments to verify the co-localization of HDAC1 and Runx2 in the nucleus and speculated that they might be in the same complex. We further confirmed by CHIP experiments that both HDAC1 and Runx2 can bind to the promoter of OPN. We found that HDAC1 significantly inhibited OPN mRNA level induced by Runx2 by transient transfection of HDAC1 into Runx2 overexpressed cell lines, but interestingly, HDAC1 had no effect on ALP mRNA level. After the enzyme activity of HDAC1 was inhibited by TSA, the level of OPN mRNA induced by Runx2 increased obviously, but the level of ALP mRNA induced by Runx2 did not change. These results suggest that the inhibitory effect of HDAC1 on OPN mRNA level induced by Runx2 is consistent with that of HDAC1 on Runx2 activation of OPN promoter, and this effect has some specificity. Our Western blot results showed that the mRNA level of OPN in osteoblasts increased significantly at the 6th day after induction of osteoblast differentiation, and the HDAC1 protein level decreased at the same time. Moreover, we also analyzed the level of HDAC1 protein in different cell lines, and found that the level of HDAC1 protein decreased gradually with the development of differentiation. These results suggest that HDAC1 may act as an inhibitory barrier during the up-regulation of OPN mRNA by Runx2 and even during the process of Runx2 inducing osteoblast differentiation, and when Runx2 passes through this barrier, HDAC1 can no longer inhibit the expression of OPN, thus promoting the regulation of Runx2. In addition, we also found that HDAC1 had no effect on the protein level of Runx2, while the protein level of Runx2 increased significantly with differentiation, so we speculated that in the process of osteoblast differentiation, There may be an epigenetic regulatory mechanism beyond HDAC1 to regulate the protein level of Runx2, thus affecting the differentiation of osteoblasts. Our studies reveal the molecular mechanism of HDAC1 inhibiting OPN mRNA level induced by Runx2, and provide a theoretical basis for the use of HDACs in the treatment of skeletal diseases.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2365513