【摘要】：目的：脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細胞特異性分泌的一種蛋白。研究表明血清脂聯(lián)素水平與代謝綜合征和腫瘤相關,而脂聯(lián)素基因啟動子變異影響其功能的發(fā)揮。我們前期探討了脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP多態(tài)性與云南漢族人群非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)發(fā)生發(fā)展的相關性,發(fā)現(xiàn)SNP-12140G等位基因有可能是NSCLC的危險因素(OR=1.516; 95% CI:1.098-2.094)。為更深一步地闡明脂聯(lián)素基因結構變異和mRNA的關系,在本研究中,我們將對脂聯(lián)素基因啟動子變異的功能進行初步探討。方法：1.利用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增APM1基因啟動子區(qū)；2.將APM1基因啟動子區(qū)連接至螢火蟲螢光素酶報告基因載體pGL4.11上,構建螢火蟲螢光素酶報告基因重組質粒；3.利用多位點基因定點突變試劑盒對重組質粒進行基因突變,獲得包含3個SNP (SNP-12140GA, SNP-11426AG, SNP-11377CG)不同組合的8個單倍體的螢火蟲螢光素酶報告基因重組質粒。4.測序分析重組質粒是否突變成功；5.重組質粒與海腎熒光素酶報告基因pGL4.74共轉染誘導分化第八天的小鼠前脂肪細胞3T3 L1；6.轉染后48h檢測螢火蟲螢光素酶的活性以反映所連接的啟動子變異的作用。結果：成功構建重組質粒,并完成基因定點突變；獲得8中不同SNP組合的單倍體重組質粒；瞬時轉染小鼠前脂肪細胞3T3L1,不同單倍型的重組質粒表達的熒光素酶報告基因活性具有差異；在8種重組質粒中,具有SNP-11377CG的C等位基因的單倍型重組質粒的螢火蟲熒光素酶報告基因活性的表達量高于G等位基因的重組質粒；在SNP-11377CG等位基因為G的4種重組質粒中,SNP-12140GA的A等位基因的重組質粒所表達的螢火蟲熒光素酶報告基因活性高于G等位基因的重組質粒；SNP-11426基因型與熒光素酶活性表達沒有明顯的關系。結論：脂聯(lián)素基因啟動子變異能夠通過影響啟動子的活性來影響脂聯(lián)素基因的表達；脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP-11377CG和SNP-12140GA可改變脂聯(lián)素啟動子的功能；SNP-11426與脂聯(lián)素啟動子的功能無明顯相關性。
[Abstract]:Objective: adiponectin (Adiponectin) is a protein secreted by adipocytes. Serum adiponectin levels were associated with metabolic syndrome and tumors, and adiponectin gene promoter mutations affected its function. We studied the association of adiponectin gene promoter SNP polymorphism with the occurrence and development of non-small cell lung cancer (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) in Yunnan Han population. We found that SNP-12140G allele may be a risk factor for NSCLC (OR=1.516;). 95% CI:1.098-2.094). In order to further elucidate the relationship between adiponectin gene structural variation and mRNA, we will explore the function of adiponectin gene promoter mutation in this study. Method 1: 1. The promoter region of APM1 gene was amplified by polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR). The promoter region of APM1 gene was ligated to the vector pGL4.11 of firefly luciferase reporter gene, and the recombinant plasmid of luciferase reporter gene was constructed. The recombinant plasmids containing 8 haploid luciferase reporter genes containing three SNP (SNP-12140GA, SNP-11426AG, SNP-11377CG) combinations were obtained by using multi-locus site-directed mutagenesis kit. 4. Sequencing analysis showed that the recombinant plasmid was successfully mutated. The recombinant plasmid was co-transfected with the pGL4.74 gene of sea kidney luciferase reporter gene into mouse preadipocytes 3T3 L1 / 6 on the eighth day of differentiation. 48 hours after transfection, the luciferase activity of firefly was detected to reflect the mutation of the linked promoter. Results: the recombinant plasmids were successfully constructed, and the haploid recombinant plasmids with different SNP combinations were obtained. After transient transfection of mouse preadipocytes 3T3L1, the luciferase reporter gene activity of different haplotype recombinant plasmids was different. Among the eight recombinant plasmids, the activity of fluorescent luciferase reporter gene in the haplotype recombinant plasmid with C allele of SNP-11377CG was higher than that in the G allele. Among the four recombinant plasmids with SNP-11377CG allele G, the activity of luciferase reporter gene of SNP-12140GA A allele was higher than that of G allele. There was no significant correlation between SNP-11426 genotype and luciferase activity. Conclusion: adiponectin gene promoter mutation can affect the expression of adiponectin gene by affecting the activity of the promoter, and SNP-11377CG and SNP-12140GA of adiponectin gene promoter can change the function of adiponectin promoter. There was no significant correlation between SNP-11426 and adiponectin promoter function.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R3416

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本文編號：2365179