【摘要】：硫化氫(H2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體,大量吸入會導致中毒。近年來,越來越多的研究表明,H2S成為繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三個氣體信號分子。內(nèi)源性H2S在機體的各個系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中,H2S可以增強NMDA受體的活性,易化長時程動作電位的產(chǎn)生,進而對記憶過程產(chǎn)生影響；H2S可以通過清除氧自由基進而發(fā)揮其保護神經(jīng)細胞的作用。在心血管系統(tǒng)中,H2S能開放ATP敏感的鉀離子(KATP)通道,使血管平滑肌舒張,降低血壓；體內(nèi)H2S生成減少與自發(fā)性高血壓的形成有密切關系,外源性給予H2S有顯著降壓效果,緩解高血壓的進程；另外,H2S可以通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮其心臟保護效應來對抗心臟的缺血/再灌注損傷。在炎癥免疫系統(tǒng)中,既有H2S抗炎效應的報道,也有H2S促炎效應的報道。另外,在機體代謝方面,H2S可以顯著地降低機體的代謝率；H2S可以調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素的釋放。H2S甚至在延長機體壽命方面也發(fā)揮著其相應的作用。 在血管新生方面,我課題組于2007年在國際上首次發(fā)現(xiàn)H2S具有顯著的促血管新生效應,該研究成果不僅在體外管腔形成實驗,而且在小鼠Matrigel Plug動物模型上都得到了證實。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型中也證實了H2S的促血管新生效應。我課題組于2009年,在大鼠一側(cè)下肢缺血模型中再次證實,外源性H2S可以顯著地促進大鼠缺血下肢的血管新生,該研究提示H2S在缺血下肢中的促血管新生效應可能通過上調(diào)骨骼肌細胞中VEGF的表達,進而作用于血管內(nèi)皮細胞中VEGFR2受體而實現(xiàn)。Andreas Papapetropoulosa等的研究證實,內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S是血管新生的促進因子；他們利用雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型,給予內(nèi)源性H2S生成酶的抑制劑顯著地抑制了血管新生過程；另外,在主動脈環(huán)血管新生模型中,CSE基因敲除小鼠的主動脈環(huán)對VEGF的血管新生反應顯著地低于野生型小鼠。他們的研究結(jié)果認為,H2S的促血管新生效應依賴于KATP channel-MAPK信號通路。然而,H2S促血管新生作用的具體分子機制并不清楚。 血管新生與血管內(nèi)皮細胞的增殖及遷移過程密切相關,其中,血管內(nèi)皮細胞的遷移過程在血管新生過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)為研究對象,主要針對H2S的促內(nèi)皮細胞的遷移效應及其具體分子機制進行研究,以期闡明H2S促血管新生的具體分子機制。 首先,我們研究了H2S對HUVECs體外血管新生的作用。用細胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型研究H2S對HUVECs遷移的影響,結(jié)果證實50μ M的NaHS處理能顯著地促進內(nèi)皮細胞的遷移能力；內(nèi)皮細胞體外管腔形成實驗結(jié)果表明,50μM的NaHS顯著促進HUVECs體外管腔的形成；用BrdU摻入法檢測H2S對HUVECs增殖的影響,結(jié)果顯示,50μM的NaHS顯著抑制HUVECs的細胞增殖。該結(jié)果提示,H2S的促HUVECs體外血管新生效應主要依賴于其促內(nèi)皮細胞遷移效應。 其次,研究H2S對HUVECs肌動蛋白細胞骨架及細胞黏著斑的影響。細胞免疫熒光結(jié)果表明,H2S使HUVECs肌動蛋白細胞骨架重構(gòu),以細胞前端片狀偽足生成增多為典型特征；H2S對HUVECs細胞paxillin-contained黏著斑的分布沒有顯著影響。Western Blot結(jié)果顯示,H2S對胞內(nèi)paxillin Tyrl18和Serl26位的磷酸化沒有影響；但是H2S可以時間依賴性地促進FAK (Tyr576/577)位的磷酸化。這些結(jié)果表明,H2S使HUVECs肌動蛋白細胞骨架重構(gòu),這很可能是H2S促內(nèi)皮細胞遷移效應的關鍵；另外,FAK的磷酸化也可能在H2S促內(nèi)皮細胞遷移效應中發(fā)揮作用。 然后,研究H2S對小G蛋白Rho家族成員活性的影響。Pull-Down結(jié)果顯示,H2S可以一過性地活化小G蛋白Rac1,但對RhoA和Cdc42的活性沒有顯著影響；G-LISA結(jié)果再次證實了H2S對Rac1的一過性活化作用；NaHS與人源性重組蛋白Rac1的細胞外直接反應結(jié)果表明,H2S并不能直接活化Rac1,該結(jié)果提示,Racl的活化是由胞內(nèi)上游信號分子的活化所介導的。 接著,研究Rac1是否介導了H2S所致的促內(nèi)皮細胞遷移效應及促血管新生效應。首先,成功地建立了內(nèi)皮細胞的電轉(zhuǎn)染體系；針對Rac1基因,分別為內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染dominate negative Rac1質(zhì)粒及對Rac1基因進行RNA干擾,細胞免疫熒光結(jié)果顯示,Rac1介導了H2S所致的HUVECs肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)；細胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型結(jié)果顯示,Rac1介導了H2S所致的促HUVECs遷移效應；體外管腔形成實驗結(jié)果顯示,Rac1介導了H2S所致的促HUVECs體外血管新生效應。 再次,我們對H2S所致Rac1活化的上下游信號通路進行了研究。應用VEGFR的阻斷劑SU5416和P13K的阻斷劑LY294002預處理,可以顯著地抑制H2S所致Rac1活化；細胞免疫熒光結(jié)果顯示,SU5416和LY294002預處理,可以抑制H2S所致的HUVECs細胞片狀偽足的伸出；同時細胞遷移實驗結(jié)果顯示,SU5416和LY294002預處理也顯著地抑制了H2S所致的促HUVECs細胞遷移效應。這些結(jié)果表明,VEGFR-PI3K信號通路介導了H2S所致的Rac1活化；VEGFR-PI3K信號通路介導了H2S所致的HUVECs細胞肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)；VEGFR-PI3K信號通路介導了H2S所致的促HUVECs細胞遷移效應。轉(zhuǎn)染dominant negativeAkt后,H2S所致的Rac1活化并不能被抑制,說明H2S所致的Rac1活化并不依賴于Akt的活化。另外,激酶抑制劑研究結(jié)果表明,ERK獨立于VEGFR-PI3K信號通路,也在H2S所致的促HUVECs遷移效應中發(fā)揮著一定的作用。轉(zhuǎn)染dominant negative Rac1質(zhì)粒及Rac1SiRNA后, H2S所致的cofilin Ser3位的磷酸化被顯著抑制,說明cofilin是Rac1的下游效應分子；cofilin作為肌動蛋白結(jié)合蛋白很可能直接調(diào)控了H2S所致的內(nèi)皮細胞肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu)。 最后,檢測CSE和CBS在HUVECs內(nèi)皮細胞的表達及在大鼠胸主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細胞層的表達與分布。RT-PCR結(jié)果顯示,在基因水平上,HUVECs內(nèi)皮細胞既表達CSE又表達CBS; Real-Time PCR結(jié)果表明,mRNA水平上CBS的表達遠高于CSE,大約是CSE基因水平的64倍之多；Western Blot結(jié)果顯示,在蛋白質(zhì)水平上,]HUVECs內(nèi)皮細胞既表達CSE同時也表達CBS；免疫組織化學結(jié)果顯示,大鼠胸主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細胞層不僅有CSE的表達,而且也有CBS的高表達。這些結(jié)果說明,在動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細胞層,不僅有CSE的表達,而且同時有CBS的表達。這為研究內(nèi)源性H2S在心血管系統(tǒng)中的作用打下了一定基礎。 總之,我們的研究首次證實了：①小G蛋白Rac1介導了H2S的體外促血管新生效應,該效應的發(fā)揮主要是通過肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)所致的內(nèi)皮細胞遷移能力增強所實現(xiàn)的；②VEGFR-PI3K信號通路介導了H2S所致的Rac1的活化；③Cofilin是Racl的下游效應分子,它可能直接介導了H2S所致的內(nèi)皮細胞肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu),進而在內(nèi)皮細胞運動過程中發(fā)揮作用；④血管內(nèi)皮系統(tǒng)既有CSE的表達,又有CBS的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R331.32

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王新寶;金紅芳;杜軍保;;新型氣體信號分子硫化氫在心血管疾病中的意義[J];中國當代兒科雜志;2009年09期

2 花旺;姜劍斌;榮星;吳蓉洲;仇慧仙;張園海;陳其;;胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氫通路在小鼠病毒性心肌炎中的表達[J];中國當代兒科雜志;2010年09期

3 孟濤;晏勇;張華;晏寧;代政偉;李潔穎;趙豐麗;彭竹蕓;易洋;;胰島素樣生長因子1對PC12細胞胱硫醚-β-合成酶和硫化氫的影響及機制[J];第二軍醫(yī)大學學報;2010年12期

4 李鋼;楊雙強;;PI3K/Akt通路在硫化氫后處理保護心肌細胞缺氧復氧損傷中的作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年17期

5 李艷兵;鐘光珍;楊新春;;內(nèi)源性氣體信號分子硫化氫對心血管系統(tǒng)離子通道的作用[J];國際心血管病雜志;2008年06期

6 饒春燕;胡昌倫;付蘭英;趙曉晏;;硫化氫通過PI3K/AKT-NF-κB通路調(diào)節(jié)重癥急性胰腺炎[J];重慶醫(yī)學;2014年29期

7 郭晶晶;晏勇;;內(nèi)源性硫化氫含量與帕金森病的相關性研究[J];重慶醫(yī)學;2014年33期

8 李雙鳳;冉珂;王亞平;唐正國;肖艷英;王丹;;硫化氫延遲預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞的保護作用[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2011年04期

9 任青愛;謝曉華;張穎;張海峰;;截肢創(chuàng)傷對大鼠心肌硫化氫/胱硫醚-γ-裂解酶體系的影響[J];中華保健醫(yī)學雜志;2008年02期

10 琚長霖;高大勝;;內(nèi)源性硫化氫在心肌缺血發(fā)病機制中的作用[J];嶺南心血管病雜志;2010年01期

相關博士學位論文 前10條

1 肖健;硫化氫通過抑制自噬減輕心肌缺血再灌注損傷的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

2 劉芳;硫化氫對大鼠急性心肌缺血損傷的作用及其機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

3 陳娣;H_2S對心肺復蘇后腦損傷的作用及其機制[D];華中科技大學;2012年

4 季永;硫化氫后處理激活線粒體ATP敏感性鉀通道和PI3K/Akt保護缺血大鼠心肌[D];中國醫(yī)科大學;2008年

5 付志方;新型氣體信號分子硫化氫在大鼠肺缺血再灌注損傷中的作用及其機制探討[D];北京大學;2008年

6 許言午;再灌注期間應用硫化氫對大鼠缺血—再灌注心肌的保護作用及其機制研究[D];山西醫(yī)科大學;2008年

7 李曉梅;缺血后適應對壓力超負荷誘導小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D];新疆醫(yī)科大學;2009年

8 王茜;大蒜有機硫化合物及其類似物的心血管保護作用[D];復旦大學;2009年

9 施珊珊;促紅細胞生成素對離體大鼠心臟缺血再灌注損傷保護作用的研究[D];浙江大學;2009年

10 唐正國;硫化氫延遲預處理對大鼠心肌的保護作用及其機制的研究[D];中南大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 段楊;硫化氫對離體豬冠狀動脈張力的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學;2011年

2 代政偉;外源性硫化氫對PC12細胞APP/Aβ代謝途徑及BACE1表達的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

3 孟濤;IGF-1對胱硫醚-β-合成酶和硫化氫的影響及相關機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

4 王曉晨;硫化氫對大鼠心功能的影響及其離子通道機制[D];寧夏醫(yī)科大學;2010年

5 潘昊;硫化氫在膿毒癥大鼠結(jié)腸黏膜損傷中的作用[D];華中科技大學;2010年

6 秦衛(wèi)偉;硫化氫對氧應激所致心肌損傷的影響及其機制的探討[D];山西醫(yī)科大學;2009年

7 金勝;硫化氫對L-NAME誘發(fā)的高血壓大鼠心功能的調(diào)變作用[D];河北醫(yī)科大學;2009年

8 謝巍;內(nèi)源性CSE/H_2S介導缺血后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的拮抗作用[D];南華大學;2008年

9 張昱;一、硫化氫對乳鼠心肌細胞缺氧損傷的保護作用 二、硫化氫對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2009年

10 程翅;硫化氫后處理對缺血心肌影響的研究[D];遵義醫(yī)學院;2009年

，

本文編號：2362656