【摘要】：硫化氫(H2S)是一種無(wú)色有臭雞蛋味的氣體,大量吸入會(huì)導(dǎo)致中毒。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明,H2S成為繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三個(gè)氣體信號(hào)分子。內(nèi)源性H2S在機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中,H2S可以增強(qiáng)NMDA受體的活性,易化長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)作電位的產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)記憶過(guò)程產(chǎn)生影響；H2S可以通過(guò)清除氧自由基進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。在心血管系統(tǒng)中,H2S能開(kāi)放ATP敏感的鉀離子(KATP)通道,使血管平滑肌舒張,降低血壓；體內(nèi)H2S生成減少與自發(fā)性高血壓的形成有密切關(guān)系,外源性給予H2S有顯著降壓效果,緩解高血壓的進(jìn)程；另外,H2S可以通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其心臟保護(hù)效應(yīng)來(lái)對(duì)抗心臟的缺血/再灌注損傷。在炎癥免疫系統(tǒng)中,既有H2S抗炎效應(yīng)的報(bào)道,也有H2S促炎效應(yīng)的報(bào)道。另外,在機(jī)體代謝方面,H2S可以顯著地降低機(jī)體的代謝率；H2S可以調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素的釋放。H2S甚至在延長(zhǎng)機(jī)體壽命方面也發(fā)揮著其相應(yīng)的作用。 在血管新生方面,我課題組于2007年在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)H2S具有顯著的促血管新生效應(yīng),該研究成果不僅在體外管腔形成實(shí)驗(yàn),而且在小鼠Matrigel Plug動(dòng)物模型上都得到了證實(shí)。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型中也證實(shí)了H2S的促血管新生效應(yīng)。我課題組于2009年,在大鼠一側(cè)下肢缺血模型中再次證實(shí),外源性H2S可以顯著地促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生,該研究提示H2S在缺血下肢中的促血管新生效應(yīng)可能通過(guò)上調(diào)骨骼肌細(xì)胞中VEGF的表達(dá),進(jìn)而作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2受體而實(shí)現(xiàn)。Andreas Papapetropoulosa等的研究證實(shí),內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S是血管新生的促進(jìn)因子；他們利用雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型,給予內(nèi)源性H2S生成酶的抑制劑顯著地抑制了血管新生過(guò)程；另外,在主動(dòng)脈環(huán)血管新生模型中,CSE基因敲除小鼠的主動(dòng)脈環(huán)對(duì)VEGF的血管新生反應(yīng)顯著地低于野生型小鼠。他們的研究結(jié)果認(rèn)為,H2S的促血管新生效應(yīng)依賴(lài)于KATP channel-MAPK信號(hào)通路。然而,H2S促血管新生作用的具體分子機(jī)制并不清楚。 血管新生與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移過(guò)程密切相關(guān),其中,血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過(guò)程在血管新生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。本研究以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)為研究對(duì)象,主要針對(duì)H2S的促內(nèi)皮細(xì)胞的遷移效應(yīng)及其具體分子機(jī)制進(jìn)行研究,以期闡明H2S促血管新生的具體分子機(jī)制。 首先,我們研究了H2S對(duì)HUVECs體外血管新生的作用。用細(xì)胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型研究H2S對(duì)HUVECs遷移的影響,結(jié)果證實(shí)50μ M的NaHS處理能顯著地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力；內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,50μM的NaHS顯著促進(jìn)HUVECs體外管腔的形成；用BrdU摻入法檢測(cè)H2S對(duì)HUVECs增殖的影響,結(jié)果顯示,50μM的NaHS顯著抑制HUVECs的細(xì)胞增殖。該結(jié)果提示,H2S的促HUVECs體外血管新生效應(yīng)主要依賴(lài)于其促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)。 其次,研究H2S對(duì)HUVECs肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及細(xì)胞黏著斑的影響。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明,H2S使HUVECs肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu),以細(xì)胞前端片狀偽足生成增多為典型特征；H2S對(duì)HUVECs細(xì)胞paxillin-contained黏著斑的分布沒(méi)有顯著影響。Western Blot結(jié)果顯示,H2S對(duì)胞內(nèi)paxillin Tyrl18和Serl26位的磷酸化沒(méi)有影響；但是H2S可以時(shí)間依賴(lài)性地促進(jìn)FAK (Tyr576/577)位的磷酸化。這些結(jié)果表明,H2S使HUVECs肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu),這很可能是H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)的關(guān)鍵；另外,FAK的磷酸化也可能在H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)中發(fā)揮作用。 然后,研究H2S對(duì)小G蛋白R(shí)ho家族成員活性的影響。Pull-Down結(jié)果顯示,H2S可以一過(guò)性地活化小G蛋白R(shí)ac1,但對(duì)RhoA和Cdc42的活性沒(méi)有顯著影響；G-LISA結(jié)果再次證實(shí)了H2S對(duì)Rac1的一過(guò)性活化作用；NaHS與人源性重組蛋白R(shí)ac1的細(xì)胞外直接反應(yīng)結(jié)果表明,H2S并不能直接活化Rac1,該結(jié)果提示,Racl的活化是由胞內(nèi)上游信號(hào)分子的活化所介導(dǎo)的。 接著,研究Rac1是否介導(dǎo)了H2S所致的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)及促血管新生效應(yīng)。首先,成功地建立了內(nèi)皮細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染體系；針對(duì)Rac1基因,分別為內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染dominate negative Rac1質(zhì)粒及對(duì)Rac1基因進(jìn)行RNA干擾,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,Rac1介導(dǎo)了H2S所致的HUVECs肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)；細(xì)胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型結(jié)果顯示,Rac1介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs遷移效應(yīng)；體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Rac1介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs體外血管新生效應(yīng)。 再次,我們對(duì)H2S所致Rac1活化的上下游信號(hào)通路進(jìn)行了研究。應(yīng)用VEGFR的阻斷劑SU5416和P13K的阻斷劑LY294002預(yù)處理,可以顯著地抑制H2S所致Rac1活化；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,SU5416和LY294002預(yù)處理,可以抑制H2S所致的HUVECs細(xì)胞片狀偽足的伸出；同時(shí)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SU5416和LY294002預(yù)處理也顯著地抑制了H2S所致的促HUVECs細(xì)胞遷移效應(yīng)。這些結(jié)果表明,VEGFR-PI3K信號(hào)通路介導(dǎo)了H2S所致的Rac1活化；VEGFR-PI3K信號(hào)通路介導(dǎo)了H2S所致的HUVECs細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)；VEGFR-PI3K信號(hào)通路介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs細(xì)胞遷移效應(yīng)。轉(zhuǎn)染dominant negativeAkt后,H2S所致的Rac1活化并不能被抑制,說(shuō)明H2S所致的Rac1活化并不依賴(lài)于Akt的活化。另外,激酶抑制劑研究結(jié)果表明,ERK獨(dú)立于VEGFR-PI3K信號(hào)通路,也在H2S所致的促HUVECs遷移效應(yīng)中發(fā)揮著一定的作用。轉(zhuǎn)染dominant negative Rac1質(zhì)粒及Rac1SiRNA后, H2S所致的cofilin Ser3位的磷酸化被顯著抑制,說(shuō)明cofilin是Rac1的下游效應(yīng)分子；cofilin作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白很可能直接調(diào)控了H2S所致的內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)。 最后,檢測(cè)CSE和CBS在HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及在大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層的表達(dá)與分布。RT-PCR結(jié)果顯示,在基因水平上,HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞既表達(dá)CSE又表達(dá)CBS; Real-Time PCR結(jié)果表明,mRNA水平上CBS的表達(dá)遠(yuǎn)高于CSE,大約是CSE基因水平的64倍之多；Western Blot結(jié)果顯示,在蛋白質(zhì)水平上,]HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞既表達(dá)CSE同時(shí)也表達(dá)CBS；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層不僅有CSE的表達(dá),而且也有CBS的高表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明,在動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層,不僅有CSE的表達(dá),而且同時(shí)有CBS的表達(dá)。這為研究?jī)?nèi)源性H2S在心血管系統(tǒng)中的作用打下了一定基礎(chǔ)。 總之,我們的研究首次證實(shí)了：①小G蛋白R(shí)ac1介導(dǎo)了H2S的體外促血管新生效應(yīng),該效應(yīng)的發(fā)揮主要是通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)所致的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)所實(shí)現(xiàn)的；②VEGFR-PI3K信號(hào)通路介導(dǎo)了H2S所致的Rac1的活化；③Cofilin是Racl的下游效應(yīng)分子,它可能直接介導(dǎo)了H2S所致的內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu),進(jìn)而在內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮作用；④血管內(nèi)皮系統(tǒng)既有CSE的表達(dá),又有CBS的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R331.32

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2362656