【摘要】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因取材方便，免疫源性低，含量豐富，不涉及社會(huì)、倫理及法律等方面的爭(zhēng)論等優(yōu)勢(shì)，是組織工程理想的種子細(xì)胞。利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）向生殖細(xì)胞的分化在體外建立研究生殖細(xì)胞發(fā)育分化的模型，對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)生、分化及調(diào)控和治療人類(lèi)不孕不育癥方面具有重要意義。研究證明間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞在適合的條件下可以向生殖細(xì)胞分化，本研究目的在于探究UC-MSCs體內(nèi)外分化為雌性生殖細(xì)胞的潛能。 本研究首先鑒定了UC-MSCs的生物學(xué)特性，包括其體外培養(yǎng)形態(tài)特征、增殖能力、分化潛能（脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)和心肌細(xì)胞）及間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。進(jìn)一步篩選UC-MSCs的體外培養(yǎng)條件并初步探究促進(jìn)其增殖的血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）對(duì)UC-MSCs增殖作用的機(jī)理。將培養(yǎng)第9代的人UC-MSCs分別添加不同濃度的PDGF，2，4，6d通過(guò)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)篩選最佳作用濃度，以最佳作用濃度PDGF作為實(shí)驗(yàn)組；以單純血清培養(yǎng)作為對(duì)照組，2，4，6d細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)觀(guān)察PDGF的促進(jìn)增殖作用，并將第9代UC-MSCs傳至第16代觀(guān)察細(xì)胞活力。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PDGF受體的表達(dá)情況，免疫熒光技術(shù)和Real Time PCR檢測(cè)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及多能性基因表達(dá)的差異。最后通過(guò)細(xì)胞周期檢測(cè)和BrdU摻入試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDGF促進(jìn)人UC-MSCs的增殖作用呈劑量依賴(lài)性。 本研究將生殖細(xì)胞特異性基因Figlα轉(zhuǎn)入U(xiǎn)C-MSCs，進(jìn)一步通過(guò)卵泡液（FF）誘導(dǎo)促進(jìn)其向卵母樣細(xì)胞分化。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染外源Figlα促進(jìn)了內(nèi)源性Figlα、Dazl、Gdf9和Zp2的表達(dá)，但未能提高FF的誘導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)染Figlα后的雌性UC-MSCs啟動(dòng)了帶有GFP熒光的Figlα啟動(dòng)子的表達(dá)。20%FF誘導(dǎo)第4d，UC-MSCs逐漸由梭形變成圓形，細(xì)胞大小約10μm。14d形成了類(lèi)卵母樣細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到40-50μm（雌性UC-MSCs來(lái)源）和25-40μm（雄性UC-MSCs來(lái)源）。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，卵母樣細(xì)胞未能繼續(xù)發(fā)育，仍然保持40μm大小。通過(guò)生殖細(xì)胞相關(guān)基因的相對(duì)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在7d和14d，生殖細(xì)胞相關(guān)特異性基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，但除Dazl外，其它基因隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸升高（雌性UC-MSCs來(lái)源），相反，（雄性UC-MSCs來(lái)源）隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至14d不僅相關(guān)基因表達(dá)量沒(méi)有升高卻呈下降趨勢(shì)（Stra8基因除外）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，14d形成的卵母樣細(xì)胞呈OCT4，VASA，DAZL，ZP2，ZP3和STRA8陽(yáng)性。雌激素是卵泡成熟和發(fā)育過(guò)程中的重要物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)誘導(dǎo)組雌激素分泌水平發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)3d，7d，14d組明顯高于對(duì)照組（0d），并且3d時(shí)，其雌激素分泌達(dá)最高峰。為研究不同性別的UC-MSCs向雌性生殖細(xì)胞分化過(guò)程中的差異性，檢測(cè)雄性生殖細(xì)胞特化時(shí)的基因Sox9和雌性生殖細(xì)胞特化時(shí)的基因Foxl2在體外誘導(dǎo)條件下向雌性生殖細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)差異。結(jié)果顯示誘導(dǎo)的6-9d雌性UC-MSCs，Sox9基因陡然升高，，甚至超過(guò)雄性，至第12d又恢復(fù)到誘導(dǎo)前較低水平。而Foxl2基因的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，尤其是在雌性UC-MSCs，F(xiàn)oxl2的表達(dá)量自始至終高于雄性。 為研究UC-MSCs在體內(nèi)分化為生殖細(xì)胞的能力，將體外經(jīng)BrdU標(biāo)記的UC-MSCs分別移植到白消安處理的雄性生殖缺陷模型鼠的曲細(xì)精管中和雌性鼠的腎被膜下。30d后通過(guò)組織切片的免疫熒光染色鑒定UC-MSCs體內(nèi)的分化情況，結(jié)果顯示BrdU陽(yáng)性UC-MSCs共表達(dá)生殖細(xì)胞特異性蛋白VASA、DAZL和ZP2。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 何紅燕;林曉波;應(yīng)文娟;林麗敏;馮學(xué)永;王鴻武;馬廉;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)定植并向心肌樣細(xì)胞分化的研究[J];中國(guó)輸血雜志;2009年03期

2 段富華;楊春;楊會(huì)營(yíng);余美春;陶暉;曾文欽;戴景興;原林;;維甲酸對(duì)脂肪源干細(xì)胞中生殖標(biāo)記表達(dá)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年01期

3 張顥;張斌;程梅;陶艷玲;扈江偉;徐曼;陳虎;;用組織貼壁法從整根臍帶分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特性的檢測(cè)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2012年01期

4 陳政;勞學(xué)軍;高明;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在肝部分切除模型大鼠體內(nèi)向肝樣細(xì)胞的分化[J];暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2011年06期

5 吳應(yīng)積,羅奮華,薛曉先,旭日干;絨山羊曲細(xì)精管生殖細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)和精子發(fā)生過(guò)程的觀(guān)察[J];內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年04期

6 杜江榕;王丹華;彭雁忠;李繼云;;不同濃度EGF對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2007年03期

7 范秀波;劉天慶;郝永杰;劉洋;馬學(xué)虎;崔占峰;;臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年08期

8 徐晉麟,徐沫;哺乳動(dòng)物性別決定和性反轉(zhuǎn)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1998年01期

9 王廣宇;趙芳;郝永蕾;朱旅云;李曉玲;胡麗葉;馬利成;單巍;楊少玲;;臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞與大鼠胰腺細(xì)胞共培養(yǎng)向胰島樣細(xì)胞分化及移植治療1型糖尿病(英文)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年40期

10 程范軍,鄒萍,仲照東,郭榮,肖娟;人臍血間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的生長(zhǎng)特征[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2003年06期

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本文編號(hào)：2359106