【摘要】：目的將貼壁狀態(tài)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞馴化成用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的懸浮CHO細(xì)胞(CHO-S),并驗(yàn)證用該懸浮細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá)的可行性。方法將貼壁狀態(tài)的CHO-S細(xì)胞調(diào)整為懸浮培養(yǎng)后,再用逐步降低血清含量的方法將其馴化成用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞。根據(jù)從噬菌體抗體庫(kù)篩選獲得的抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單鏈抗體的基因序列,人工設(shè)計(jì)并合成其重鏈和輕鏈基因,分別克隆入真核表達(dá)載體pc DNA3.1中,所得載體命名為pc DNA3.1-HC和pc DNA3.1-LC。將構(gòu)建好的2個(gè)載體按照輕、重鏈比例為3∶1的量用Free Style MAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,轉(zhuǎn)染7 d后收集培養(yǎng)上清,用SDS-PAGE和Western blot法檢測(cè)抗體表達(dá)情況,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其與PSMA陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合活性。結(jié)果成功將貼壁CHO細(xì)胞馴化成懸浮CHO-S細(xì)胞,成功構(gòu)建了表達(dá)抗PSMA人源性抗體重鏈和輕鏈基因的真核表達(dá)載體,并在CHO-S細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了抗體的分泌表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)其可特異性結(jié)合PSMA陽(yáng)性前列腺癌細(xì)胞。結(jié)論成功馴化獲得懸浮CHO-S細(xì)胞,馴化后的CHO-S細(xì)胞可用于抗體的真核表達(dá),為后續(xù)抗體的大量表達(dá)純化及功能研究提供了工具。
[Abstract]:Objective to acclimate the adherent Chinese hamster ovarian (CHO) cells into suspension CHO cells (CHO-S) cultured in serum-free medium and verify the feasibility of using the suspension cells for antibody expression. Methods after adjusting the adherent CHO-S cells to suspension culture, they were acclimated into CHO-S cells suspended on serum-free medium by gradually decreasing the serum content. According to the gene sequence of anti-prostate specific membrane antigen (PSMA) single-chain antibody screened from phage antibody library, the heavy chain and light chain genes were designed and synthesized and cloned into eukaryotic expression vector pc DNA3.1, respectively. The resulting vectors were named pc DNA3.1-HC and pc DNA3.1-LC. The constructed two vectors were transiently transfected into CHO-S cells by Free Style MAX transfection reagent at a light and heavy chain ratio of 3:1. The supernatants were collected after 7 days of transfection, and the antibody expression was detected by SDS-PAGE and Western blot methods. The binding activity of PSMA positive cells was detected by flow cytometry. Results the adherent CHO cells were successfully acclimated into suspension CHO-S cells, and the eukaryotic expression vectors expressing the heavy and light chain genes of human antibody against PSMA were successfully constructed, and the secreted expression of antibodies was realized in CHO-S cells. Flow cytometry confirmed that it could specifically bind to PSMA positive prostate cancer cells. Conclusion suspension CHO-S cells were successfully acclimated, and CHO-S cells after acclimation could be used for eukaryotic expression of antibodies, which provided a tool for the subsequent purification and functional study of antibodies.
【作者單位】： 第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室;第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科;唐都醫(yī)院泌尿外科;
【基金】：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2013CB530500) 國(guó)家自然科學(xué)基金(81172146)
【分類號(hào)】：R392-33

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本文編號(hào)：2352432