發(fā)布時間：2018-11-22 12:34

【摘要】：背景及目的 同種異體輸血( allogeneic blood transfusion, ABT)發(fā)揮臨床治療作用的同時，也會并發(fā)很多免疫相關(guān)的副作用。輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)((transfusion-relatedimmunomodulation,TR工M)是輸血導(dǎo)致免疫系統(tǒng)改變的以免疫抑制為特征的綜合征，TR工M發(fā)生的確切機制尚不清楚。臨床常見的并發(fā)TR工M導(dǎo)致免疫抑制的嚴重后果為術(shù)后感染和腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。 一方而，血液在保存過程中，紅細胞懸液中的白細胞和血小板釋放的多種生物活性物質(zhì)會隨儲存時間延長而濃度升高，這些活性分子隨血液輸入機體內(nèi)，可能是引起輸fffL相關(guān)急性肺損傷(Transfusion-related acute lung injury,TRALI)、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(system is inflammatory response syndrome ,SIRS)等一系列不利TR工M的原因。目前，由于臨床輸血的復(fù)雜性，有關(guān)TR工M發(fā)生的臨床報道仍存在爭議，對于庫存紅細胞輸注引起受者的炎癥反應(yīng)，尚需要相關(guān)的基礎(chǔ)研究支持。 此外，庫存紅細胞輸注造成的炎癥反應(yīng)機制國內(nèi)外尚無定論，這也是本研究的切入點。目前的研究己知，各種刺激信號必須與其相應(yīng)靶細胞膜上的受體結(jié)合，通過其特定的信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。核因子KB (nuclear factor kappaB,N F-KB)作為多種信號傳導(dǎo)途徑中的樞紐，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種炎性因子的中心環(huán)節(jié)和共同通路。靜息狀態(tài)下，NF-KB復(fù)合物與抑制因子工KB相結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。在不同的刺激因素作用下，不同的上游信號可導(dǎo)致工KB蛋白磷酸化、泛素化而被蛋白酶降解，NF-KB復(fù)合物被釋放出來并向核內(nèi)遷移，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄�？梢奛F-KB活化的關(guān)鍵是工KB的降解和復(fù)合物的核移位。SN50是NF-KB抑制劑，能特異性阻止NF-KB自細胞漿移至核內(nèi)，從而抑制NF-KB的DNA結(jié)合活性。本研究通過檢測工KB-a蛋白水平的變化，同時使用SN50阻斷NF-KB的活化，探討NF-KB的信號途徑在庫存紅細胞輸注引起受者炎癥反應(yīng)中的作用。 另一方而，NK細胞可以直接殺傷腫瘤細胞和受感染的細胞，，在天然免疫應(yīng)答和炎癥中都發(fā)揮著重要作用。目前在一些腫瘤治療上，發(fā)現(xiàn)異源反應(yīng)性NK細胞顯示出比自體或相容NK細胞更強的殺傷活性。那么通過異體輸血主動發(fā)揮NK細胞異源反應(yīng)作用，可能是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)輸血相關(guān)免疫抑制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NK細胞表而的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)能夠特異性識別并結(jié)合靶細胞表而的HLA一工類分子，傳導(dǎo)抑制或活化信號，決定著NK細胞異源反應(yīng)性的發(fā)揮。K工R分為抑制型(DL)和活化型(D S)受體兩組，均能與其特定的配體結(jié)合，分別介導(dǎo)抑制性或活化性反應(yīng)。當供者NK細胞的抑制性受體不能與其HLA一工類分子配體結(jié)合或者與受者的HLA一工類分子不相容時，同時‘供受者HLA一工類抗原不合，就會產(chǎn)生抗白血病的NK細胞異源反應(yīng)性。探討能否像交叉配血一樣，在腫瘤患者輸血前做K工R和HLA一工類分子配型，誘導(dǎo)產(chǎn)生NK細胞的異源性反應(yīng)，將為不利TR工M的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)提供新的思路。 方法 第一部分: 1將制備好的懸浮紅細胞(紅細胞保養(yǎng)液為CPDA)，保存于4 0C;分別于保存1d, 21d和35d D1, D21和D35)，無菌條件下取出30m1血液，1 SOOrpm離心20min得到上清，將上清12, S OOrpm再次離心Smin以去除細胞，將上清分裝后于一20 0C凍存?zhèn)溆谩?2新鮮分離健康獻血者外周血單個核細胞(PBMC，在24孔板中，以2X1護個細胞/孔培養(yǎng)于總體積為l .5m1的完全1640培養(yǎng)基中。PBMC分組:Cl)未加LPS組:分別加入相當于總體積20%的Dl, D21和D35的懸浮紅細胞上清，培養(yǎng)48hrs后收集細胞培養(yǎng)上清凍存待檢;C2)加LPS組:分別加入總體積20%的Dl, D21和D35分離的上清，培養(yǎng)24hrs后，加入終濃度為100ng/ml的LPS，再繼續(xù)培養(yǎng)24hrs后收集細胞培養(yǎng)上清凍存待檢;兩組都分別設(shè)空白對照(不加紅細胞上清，其他按分組處理)。 3檢測10份Dl, D21和D35紅細胞上清的游離血紅蛋白、鉀、鈉、鈣、氯離子濃度，其中包括用于細胞培養(yǎng)的7份上清。 4用ELISA試劑盒分別檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子兒-1p、工L-6,IL-lO,IL-17, TNF-a, TGF-p及GM-CSF的濃度變化。 第二部分: 1按第一部分方法進行細胞培養(yǎng)，48hrs后收獲細胞，用蛋白免疫印跡法western blot)檢測IKB-a蛋白水平的變化。 2用NF-KB特異性阻斷劑SN50處理后，檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-a濃度的變化。細胞分組:(1)單加LPS組，(2)單加SN50組，(3) SN50預(yù)處理組;每組都設(shè)空白對照(不加紅細胞上清，其他按分組處理)。 第三部分: 用PCR-SSP方法對獻血員進行K工R分型，按照供血者的K工R與受血者HLA-工類分子不同匹配程度分組，進行回顧性病例一對照研究。白血病組共53例，實體瘤組共27例。在輸血前及輸血后Sd內(nèi)分別采集受血者外周靜脈血，用流式細胞術(shù)和ELISA方法分別檢測受fffL者輸fffL前后的CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+,CD19+, CD3-CD56+細胞的百分比和血清中細胞因子TNF-a, IFN-y的濃度變化。結(jié)果 1懸浮紅細胞上清液中，F(xiàn)Hb, K+, Ca2+的含量隨保存時間延長而逐漸增高CP0.05}，N a+則逐漸降低(P0.05}，各項受檢指標均在國家規(guī)定血液質(zhì)量正常范圍內(nèi)。 2在LPS誘導(dǎo)下，D35與Dl的紅細胞上清相比，促進了PBMC分泌TNF-a和IL-6 CP0.05}; TGF-p則逐步減少(P0.05} o 3在LPS誘導(dǎo)下，隨加入紅細胞上清的保存時間延長，PBMC的工KB-a降解逐漸增加。 4加入SN50抑制TNF-a的產(chǎn)生(P0.05 ) o 5患者血清中IFN-y的濃度隨著獻血者KIR與患者HLA一工類分子不相合程度的加大而增加(P0.05;在患者輸血后，血清中IFN-y濃度的變化與患者NK細胞數(shù)的變化顯著相關(guān)(r=0.60175 } P0.0001) o 結(jié)論 1隨懸浮紅細胞保存時間的延長，輸血會增強LPS誘導(dǎo)的受者的炎癥反應(yīng)，這為進一步闡明臨床嚴重創(chuàng)傷患者大量輸血后的相關(guān)免疫反應(yīng)提供了理論依據(jù)。 2工KB-a降解的逐漸增加，說明庫存紅細胞上清能促進LPS誘導(dǎo)NF-KB的活化作用;而SN50能夠抑制這種效應(yīng)，推論NF-KB信號途徑，參與了庫存紅細胞上清協(xié)同增強LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 3供/受血者KIR與HLA不相合程度與腫瘤患者輸血后免疫功能的變化有關(guān)，這為進一步應(yīng)用異源反應(yīng)NK細胞逆轉(zhuǎn)輸血相關(guān)免疫抑制作用提供了實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2349389