【摘要】：目的:構(gòu)建人血清白蛋白(HSA)-胸腺五肽(TP5)融合蛋白表達(dá)載體,并在畢赤酵母中表達(dá),闡明其生物學(xué)活性。方法:利用基因重組技術(shù)構(gòu)建HSA-TP5融合基因,并轉(zhuǎn)染至畢赤酵母中從而構(gòu)建其真核表達(dá)體系,通過瓊脂糖凝膠電泳分離及試劑盒純化獲得PPICZαC-HSA-TP5真核重組表達(dá)質(zhì)粒;采用兩步發(fā)酵法對HSA-TP5基因工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵,對發(fā)酵液上清蛋白沉淀濃縮,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、陽離子交換層析及疏水層析等方法分離純化蛋白;采用MTT法檢測該融合蛋白促淋巴細(xì)胞增殖活性。結(jié)果:PCR法獲得HSA目的基因片段長度為1 845bp。酶切鑒定融合質(zhì)粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段長度為707bp。測序分析,目的基因HSA和TP5序列與GenBank公布的基因序列完全一致,并正向連接融合。PCR法鑒定PPICZαC-HSA-TP5真核重組質(zhì)粒與酵母基因組DNA整合,與對照組比較,轉(zhuǎn)化組出現(xiàn)基因片段長度為1 860bp。SDS-PAGE分析,在甲醇誘導(dǎo)后72h內(nèi),隨著誘導(dǎo)時間延長,HSA-TP5融合蛋白表達(dá)量逐步升高。利用陽離子交換層析及AKTA多功能蛋白純化系統(tǒng)純化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法檢測,HSA-TP5融合蛋白與TP5蛋白具有一致的促淋巴細(xì)胞增殖活性。結(jié)論:通過構(gòu)建HSA-TP5畢赤酵母真核表達(dá)體系可獲得HSA-TP5融合蛋白并具有生物學(xué)活性。
[Abstract]:Aim: to construct a fusion protein vector of human serum albumin (HSA) (HSA) thymus pentapeptide (TP5) and express it in Pichia pastoris to elucidate its biological activity. Methods: HSA-TP5 fusion gene was constructed by gene recombination and transfected into Pichia pastoris to construct its eukaryotic expression system. The eukaryotic expression plasmid of PPICZ 偽 C-HSA-TP5 was isolated by agarose gel electrophoresis and purified by kit. High-density fermentation of HSA-TP5 genetically engineered bacteria was carried out by two-step fermentation. The protein was precipitated and concentrated on the fermentation broth. The protein was separated and purified by SDS- polyacrylamide gel electrophoresis, cation exchange chromatography and hydrophobic chromatography. The MTT assay was used to detect the proliferative activity of the fusion protein. Results: the length of target gene fragment of HSA obtained by PCR was 1 845 BP. The length of the fusion plasmid HSA-TP5-pPICZ 偽 C was 707bp. Sequence analysis showed that the sequence of HSA and TP5 was identical with that of GenBank, and the recombinant plasmid of PPICZ 偽 C-HSA-TP5 was identified by PCR, and compared with the control group. The gene fragment length was 1 860bp.SDS-PAGE analysis in the transformed group. Within 72 hours after methanol induction, the expression of HSA-TP5 fusion protein increased gradually with the prolongation of the induction time. HSA-TP5 fusion protein was purified by cationic exchange chromatography and AKTA multifunctional protein purification system. MTT assay showed that HSA-TP5 fusion protein and TP5 protein had the same lymphocyte proliferation activity. Conclusion: HSA-TP5 fusion protein can be obtained by constructing the eukaryotic expression system of HSA-TP5 Pichia pastoris and has biological activity.
【作者單位】： 北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心;北京大學(xué)人民醫(yī)院血液研究所骨髓移植病房;北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外1科;吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程教研室;
【基金】：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目資助課題(吉教科合字[2014]第173號) 吉林省科技廳分子老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室項目資助課題(20130624003JC) 吉林省吉林市科技計劃項目資助課題(201437024,2015233007)
【分類號】：Q78;R3416

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本文編號：2341778