【摘要】：釘螺是日本血吸蟲唯一的中間宿主。血吸蟲幼蟲在螺體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程,即從尾蚴侵入螺體,經(jīng)母胞蚴、子胞蚴等無(wú)性繁殖,形成尾蚴,直至逸出螺體,是血吸蟲完成完整的生活史和導(dǎo)致疾病傳播的必需階段。螺類能否被成功感染和寄生,是血吸蟲的感染能力和螺宿主的防御能力共同作用的結(jié)果。因此,對(duì)于血吸蟲—螺宿主之間相互關(guān)系的研究對(duì)于最終控制血吸蟲病的傳播具有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。 本研究以自然感染血吸蟲的湖北釘螺為研究對(duì)象,首先利用抑制差減雜交技術(shù),建立了湖北釘螺頭足部(富含淋巴細(xì)胞和淋巴液,被認(rèn)為是螺體天然防御系統(tǒng)的重要部位)在慢性感染階段的正向(陽(yáng)性釘螺中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子)和反向(陰性釘螺中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子)cDNA文庫(kù)。共獲得884個(gè)克隆,其中正向文庫(kù)648個(gè),反向文庫(kù)236個(gè)。經(jīng)PCR鑒定,695個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物為大于100bp的單一有效條帶,其中正向文庫(kù)511個(gè),反向文庫(kù)184個(gè)。經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序,排除無(wú)效序列,并通過(guò)ClustalX分析,獲得102條獨(dú)立序列,其中正向文庫(kù)轉(zhuǎn)錄子60個(gè),反向文庫(kù)轉(zhuǎn)錄子42個(gè)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)斑點(diǎn)雜交進(jìn)一步篩選,獲得在慢性感染階段有顯著表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄子39個(gè),其中正向文庫(kù)9個(gè),反向文庫(kù)30個(gè)。經(jīng)BLAST分析,從已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出與轉(zhuǎn)座酶,小窩蛋白樣蛋白,胰蛋白酶抑制劑樣蛋白,鞘脂激活蛋白原,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和某些假定蛋白等具有同源性的基因,但大部分轉(zhuǎn)錄子無(wú)法從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得有效信息。經(jīng)GO分析,這些被鑒定的基因功能主要與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及免疫反應(yīng)有關(guān)。在對(duì)39個(gè)轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行半定量PCR的基礎(chǔ)上,選擇了其中的13個(gè)轉(zhuǎn)錄子(2個(gè)正向文庫(kù)轉(zhuǎn)錄子,11個(gè)反向文庫(kù)轉(zhuǎn)錄子)進(jìn)行了熒光定量PCR,其中10個(gè)轉(zhuǎn)錄子表現(xiàn)出與抑制差減雜交結(jié)果一致的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上,選擇了7個(gè)轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行了cDNA全長(zhǎng)的擴(kuò)增和克隆,包含正向文庫(kù)的HS576353和HS576355,反向文庫(kù)的HS576359,HS576367,HS576368,HS576380和HS576382。cDNA全長(zhǎng)序列表明HS576353和HS576355來(lái)源于同 個(gè)基因的不同區(qū)域,但經(jīng)BLAST分析,未能在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同源性基因。HS576359的cDNA全長(zhǎng)與HS576353(HS576353)的cDNA全長(zhǎng)序列有部分同源,可能為具有不同功能的同一類基因。膠原蛋白,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和胰蛋白酶抑制劑素等分別被克隆和鑒定。 以胰蛋白酶抑制劑為代表,檢測(cè)了其在釘螺人工感染后3h至64d,表達(dá)水平的變化。其表達(dá)水平從感染早期的上調(diào)水平逐漸降至感染后期和慢性期的下調(diào),提示胰蛋白酶抑制劑在釘螺的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用,在感染早期參與寄生蟲的清除和滅活過(guò)程,而在后期至慢性階段協(xié)助釘螺免疫防御系統(tǒng)處于抑制狀態(tài),有助于寄生蟲與釘螺之間的平衡和共存。 根據(jù)基因的表達(dá)水平差異和功能分析預(yù)測(cè),有必要進(jìn)一步對(duì)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶,胰蛋白酶抑制劑樣蛋白,鈣聯(lián)蛋白相關(guān)基因(HS576367)口某些未知基因HS576353、HS576359等進(jìn)行功能研究。這些已鑒定的具有顯著表達(dá)差異的基因可能在血吸蟲—螺類的相互關(guān)系中發(fā)揮重要作用,有助于深入認(rèn)識(shí)釘螺的天然防御系統(tǒng),特別是在共存適應(yīng)階段的分子機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R383.2

【參考文獻(xiàn)】

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張紅梅;日本血吸蟲中間宿主的遺傳學(xué)及免疫學(xué)研究[D];蘇州大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2340025