【摘要】：肝臟是人體物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換及營養(yǎng)供應(yīng)的中樞，是機(jī)體內(nèi)多種重要信息調(diào)控分子的“集散地”。與其他器官顯著不同的是，平時僅0．0012%～0．01％肝細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，從細(xì)胞增殖角度看被認(rèn)為是靜止器官，但在重大創(chuàng)傷如肝大部切除術(shù)、中毒、感染壞死以及肝移植術(shù)后等導(dǎo)致部分肝臟喪失后，肝臟細(xì)胞能通過DNA合成和有絲分裂重建與機(jī)體大小相適應(yīng)的肝臟體積并恢復(fù)功能。在肝臟70%大部切除后的肝再生模型中，肝臟是由剩余的肝葉經(jīng)1-2周時間增大直至恢復(fù)原肝的重量，旦恢復(fù)到原肝的重量，細(xì)胞增殖即停止，這過程被稱為肝大部切除后肝再生。在正常情況下人體肝臟在3天內(nèi)開始增生，在6個月內(nèi)達(dá)到原肝重量。肝再生直是哺乳動物肝臟研究中的個重要熱點(diǎn)，研究肝再生分子機(jī)理必將對肝臟移植、創(chuàng)傷、肝腫瘤等各種肝臟疾病的診斷和治療具有重要意義。肝臟再生的機(jī)制非常復(fù)雜，影響因素眾多，盡管對肝再生的機(jī)制進(jìn)行了大量的卓有成效的研究，但是對肝再生的分子機(jī)理，尤其是肝再生啟動的機(jī)制仍然需要深入研究。 MicroRNAs(miRNAs)是類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性調(diào)節(jié)小RNA，通過與靶基因的互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，miRNAs參與生物體的生長、發(fā)育、疾病和衰老等眾多生命過程的各個環(huán)節(jié)，包括器官發(fā)育、物質(zhì)代謝、細(xì)胞分化、凋亡和癌變等等，研究發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)最少有30%的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)，miRNA是目前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域，而miRNA在肝再生中作用仍然有待于進(jìn)步深入闡明，特別是在肝再生的早期miRNA的作用機(jī)制鮮見報道。 為了闡明miRNA在肝再生啟動階段的作用，本課題利用經(jīng)典的大鼠肝再生模型，通過miRNA芯片技術(shù)對大鼠肝大部切除3小時后差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了篩選并利用反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-127的表達(dá)下調(diào)最明顯。為了闡明miR-127在肝再生過程中的作用機(jī)制，本課題通過過表達(dá)和抑制表達(dá)等方法，在細(xì)胞、動物和裸鼠荷瘤模型中對miR-127的作用特點(diǎn)及其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了研究。 第一部分miR-127在大鼠肝再生過程中的作用機(jī)制研究 雖然有關(guān)miR-127在肝再生的作用未見報道，但根據(jù)我們對其在肝再生過程中表達(dá)的芯片結(jié)果提示miR-127在肝再生過程中可能發(fā)揮著重要的作用。為了進(jìn)步闡明其作用機(jī)制，我們首先檢測了miR-127及其候選靶基因在整個肝再生過程中的表達(dá)情況。并在細(xì)胞水平應(yīng)用microRNA mimics和microRNA inhibitor模擬miR-127的細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)和下調(diào)，對miR-127在正常大鼠肝細(xì)胞中的作用進(jìn)行了初步探討，特別是miR-127對肝再生過程中常表現(xiàn)出來的生物學(xué)改變?nèi)缂?xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的改變的影響進(jìn)行了探討。為了闡明miR-127調(diào)控細(xì)胞生長的機(jī)制，我們進(jìn)步應(yīng)用Western Blotting和qPCR檢測了BRL-3A細(xì)胞在過表達(dá)miR-127后其靶基因的表達(dá)情況，并通過熒光素酶報告實驗證實了miR-127通過靶基因的3’UTR來發(fā)揮抑制Sept7和Setd8的作用。為了闡明miR-127的上游調(diào)控機(jī)制，我們應(yīng)用亞硫酸鹽測序法驗證了其上游啟動序列對miR-127表達(dá)影響。 我們的結(jié)果證實：miR-127在肝再生的早期發(fā)揮了重要作用，在肝再生的整個過程中，miR-127的表達(dá)呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化，在肝大部切除后24小時下調(diào)最為顯著；在肝細(xì)胞中過表達(dá)后具有明顯抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，在肝再生的早期可以通過直接抑制Bcl6、Sept7和Setd8的表達(dá)參與肝再生啟動過程的調(diào)控；而肝再生過程中miR-127的低表達(dá)是通過其啟動子區(qū)的CpG島的甲基化來調(diào)節(jié)的。 第二部分miR-127在肝細(xì)胞癌中的作用研究 大量證據(jù)顯示miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在不同腫瘤中miRNA具有特定的表達(dá)模式，具備鑒別腫瘤類型和早期診斷的潛能。肝細(xì)胞癌（HCC）是人類最常見的腫瘤之，在全球腫瘤死亡原因中位列第五，中國大陸肝癌發(fā)病率更是占全球發(fā)病率的55%，，目前在肝癌診療中還存在早期診斷難、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高及治療手段少的問題，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還有待于進(jìn)步闡明。顯然，深入研究miRNA在肝癌中的作用和機(jī)制將有助于闡明肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及復(fù)發(fā)等的分子機(jī)制，有助于進(jìn)步探索肝癌的早期診斷和治療的新方法�；诎┌Y中miRNA的普遍下調(diào)以及肝臟再生的啟動與肝癌發(fā)生相關(guān)性我們對miR-127在肝癌中作用做了初步的探討。 我們的結(jié)果顯示：miR-127具有抑制人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞增殖的作用；與癌旁組織相比人肝癌組織中miR-127的表達(dá)明顯降低，其靶基因Bcl6的表達(dá)則明顯升高；在人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞中miR-127也具有抑制其靶基因Bcl6、Sept7和Setd8的表達(dá)的作用；在裸鼠荷瘤模型中證實miR-127可以抑制人類肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞形成的腫瘤的增殖。結(jié)果提示在人肝癌中miR-127的下調(diào)可能通過激活Bcl6的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。 結(jié)論：miR-127在肝再生早期的下調(diào)表達(dá)通過直接作用于其靶基因Bcl6、Sept7和Setd8促進(jìn)了肝再生的啟動，而miR-127的下調(diào)表達(dá)是由其啟動子的CpG島的快速甲基化調(diào)節(jié)。在人肝癌中miR-127可能通過Bcl6促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。我們的研究揭示了肝再生早期過程中的個由miRNA介導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控機(jī)制；提示了miR-127在肝癌的診治中可能具有潛在的應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 張小勇;倪明;陳姍姍;呂婷婷;余冰;陸蒙吉;;肝臟內(nèi)源性microRNA調(diào)控乙型肝炎病毒基因的表達(dá)與復(fù)制[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2008年03期

本文編號：2333643