發(fā)布時間：2018-11-12 18:11

【摘要】：目的: 干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor3,IRF-3)是IRF家族的一個成員,是調(diào)節(jié)I型干擾素(即干擾素α和β)基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,參與抗病毒感染,包括SARS病毒和丙型肝炎病毒感染,抗細胞內(nèi)細菌感染。本課題組的前期工作抽取腎上腺嗜鉻細胞瘤組織RNA,通過5'RACE(rapid amplification of cDNA ends)在IRF-3基因第二內(nèi)含子內(nèi)、第三外顯子前162位發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄起始位點,與之對應(yīng)的新的剪接異構(gòu)體命名為Int2V2。本課題克隆IRF-3基因第二內(nèi)含子中新剪接異構(gòu)體2(intron2 variant2,Int2V2)啟動子區(qū),研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制以及不同病毒類似物對Int2V2啟動子的影響,為最終闡明IRF-3多個剪接異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.以人類基因組DNA為模板,通過PCR定向克隆策略,構(gòu)建了覆蓋IRF-3基因第二內(nèi)含子內(nèi)新轉(zhuǎn)錄起始位點(第三外顯子前162bp)上下游800bp區(qū)域的熒光素酶報告基因重組體。2.應(yīng)用TFSEARCH ver.1.3軟件對Int2V2啟動子區(qū)序列進行分析,對可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測,根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄起始位點,采用PCR的方法構(gòu)建一系列缺失突變體,并瞬時轉(zhuǎn)染AD293及Hela細胞,用Luciferase檢測報告基因啟動子的活性,計算相對熒光素酶活性單位(RLU)。3.利用點突變技術(shù)及過表達試驗驗證轉(zhuǎn)錄因子對Int2V2啟動子活性的調(diào)節(jié)。4.利用共轉(zhuǎn)染研究不同病毒類似物(polyI:C、polydA:dT)對Int2V2啟動子及其mRNA水平的影響。 結(jié)果: 1.酶切、測序鑒定證實成功構(gòu)建含有IRF-3基因第二內(nèi)含子中新轉(zhuǎn)錄起始位點上下游800bp的啟動區(qū)的表達質(zhì)粒。2.啟動子活性分析表明,IRF-3第二內(nèi)含子中新轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)域的啟動子活性與正常的pGL3-Basic基本質(zhì)粒比較,其啟動子活性增加了10倍,提示新轉(zhuǎn)錄起始位點上游具啟動子活性。-317～+30區(qū)域的啟動子活性顯著升高,而-110～+30區(qū)域的啟動子活性明顯下降,表明維持其基本轉(zhuǎn)錄活性的必需調(diào)控元件在-317 bp至-110 bp之間,采用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測分析軟件分析表明,該區(qū)域內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)結(jié)合位點。3.將CREB結(jié)合位點進行點突變后啟動子活性下降近50%,過表達后啟動子活性上升近40%。4.病毒類似物刺激HEK293細胞后Int2V2啟動子活性及mRNA水平均有升高。 結(jié)論 1. IRF-3第二內(nèi)含子內(nèi)新轉(zhuǎn)錄起始位點上游具啟動子活性。2. -317 bp至-110 bp區(qū)存在必需調(diào)控元件,轉(zhuǎn)錄因子CREB可能參與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。3.轉(zhuǎn)錄因子CREB對啟動子活性具有調(diào)控作用。4.病毒類似物可影響新啟動子的活性及其mRNA水平。
[Abstract]:Objective: interferon regulatory factor 3 (Interferon regulatory factor3,IRF-3) is a member of the IRF family and a key transcription factor regulating the gene expression of interferon type I (interferon 偽 and 尾), and is involved in antiviral infection. Including SARS virus and hepatitis C virus infection, anti-bacterial infection in cells. In our previous work, we extracted RNA, from adrenal pheochromocytoma and discovered new transcriptional initiation sites in the second intron of the IRF-3 gene and in the first 162 positions of the third exon through 5'RACE (rapid amplification of cDNA ends). The corresponding new splicing isomer is named Int2V2. In this study, we cloned the new splicing isomer 2 (intron2 variant2,Int2V2) promoter in the second intron of IRF-3 gene and studied its transcriptional regulation mechanism and the effect of different viral analogues on Int2V2 promoter. It lays a foundation for elucidating the transcriptional regulation of multiple splicing isomers of IRF-3. Methods: 1. Using human genomic DNA as template, the recombinant luciferase reporter gene covering the upstream and downstream 800bp region of the second intron of IRF-3 gene (pre-exon 3 162bp) was constructed by PCR directed cloning strategy. 2. The sequence of Int2V2 promoter region was analyzed by TFSEARCH ver.1.3 software, and the possible transcription factor binding sites were predicted. According to transcription factors and transcription initiation sites, a series of deletion mutants were constructed by PCR method. After transient transfection of AD293 and Hela cells, the activity of reporter gene promoter was detected by Luciferase, and the relative luciferase activity unit (RLU). 3 was calculated. Point mutation technique and overexpression test were used to verify the regulation of transcription factors on the activity of Int2V2 promoter. 4. 4. The effect of different viral analogue (polyI:C,polydA:dT) on Int2V2 promoter and its mRNA level was studied by co-transfection. Results: 1. Restriction endonuclease digestion and sequencing confirmed the successful construction of the promoter region containing the upstream and downstream 800bp in the second intron of the IRF-3 gene. Promoter activity analysis showed that the promoter activity of the upstream region of the new transcriptional initiation site in the second intron of IRF-3 was 10 times higher than that of the normal pGL3-Basic basic plasmid. These results suggested that the promoter activity in the upstream of the new transcription initiation site was significantly increased in the region of -317 ~ 30, but decreased in the region of -110 ~ 30. The essential regulatory elements for maintaining their basic transcriptional activity ranged from -317 bp to -110 bp. The analysis of transcription factor binding site predictive analysis software showed that the transcription factor cAMP responsive element binding protein (cAMP response element binding protein, existed in the region. CREB) binding site. The promoter activity decreased nearly 50% after point mutation of CREB binding site, and increased nearly 40% after overexpression. The activity of Int2V2 promoter and the level of mRNA increased after HEK293 cells stimulated by virus analogue. Conclusion 1. The promoter activity was found in the upstream of the new transcriptional initiation site in the second intron of IRF-3. 2. From -317 bp to -110 bp, there are necessary regulatory elements, and the transcription factor CREB may be involved in its transcriptional regulation. 3. 3. Transcription factor CREB can regulate promoter activity. 4. Viral analogues can affect the activity of the new promoter and its mRNA level.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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本文編號：2327825