【摘要】：HECT類泛素連接酶（E3）在骨穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生、病毒感染等過程中發(fā)揮重要功能，但其活性調(diào)控機制還很不清楚。Nedd8介導(dǎo)的類泛素修飾稱為Neddylation。已知Neddylation修飾是Cullin-Ring類E3激活的必需條件，但其與HECT類E3的關(guān)系尚未見報道。本工作發(fā)現(xiàn)HECT類泛素連接酶Smurf1和類泛素蛋白Nedd8互作。Smurf1的蛋白穩(wěn)定性和E3活性受到類泛素蛋白Nedd8的調(diào)控，且調(diào)控依賴Nedd8的Neddylation修飾能力。Smurf1能夠被Nedd8進行Neddylation修飾，尤其在體外修飾體系中，Smurf1可以自我催化發(fā)生Neddylation修飾。另外，Smurf1可以與Neddylation修飾反應(yīng)的E2Ubc12直接相互作用，Smurf1的HECT N-lobe小亞基介導(dǎo)與Ubc12相互作用，Ubc12的N末端1-26氨基酸殘基，及中部核心結(jié)構(gòu)域的活性中心H88-D89是結(jié)合Smurf1所必須的。Smurf1自我催化Neddylation修飾的酶活中心是C426，這個位點突變后Smurf1在體內(nèi)將不能發(fā)生Neddylation修飾。HECT催化結(jié)構(gòu)域中的C426突變后直接影響Smurf1對底物，如Smad5、RhoA等的泛素化降解。研究中還發(fā)現(xiàn)Smurf2具有與Smurf1類似的效應(yīng)與機制。本工作在國際上首次建立HECT類E3與類泛素修飾之間的功能關(guān)聯(lián)，且發(fā)現(xiàn)了一類新的HECT類E3活性調(diào)控機制。 為了鑒定Smurf1更多的底物以拓展它的生物學(xué)功能，我們以Smurf1的WW結(jié)構(gòu)域為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到KLF2為其結(jié)合蛋白。KLF2屬于Krüppel樣家族蛋白成員，主要參與肺的正常發(fā)育，T細胞分化、遷移。本工作發(fā)現(xiàn)肺癌細胞中的KLF2為Smurf1在細胞核內(nèi)的靶向降解底物。一系列泛素化修飾實驗表明在肺癌細胞H1299中Smurf1為KLF2主要的泛素化降解E3。Smurf1靶向降解KLF2后將影響其轉(zhuǎn)錄因子活性及其對下游靶基因CD62L和Wee1的調(diào)控。 除了以Smurf1為線索的主體工作外，，我們揭示ATM可以磷酸化修飾微管結(jié)合蛋白NuSAP，修飾位點是NuSAP S124位點。ATM磷酸化修飾和結(jié)合NuSAP均發(fā)生于M期。此外，我們還發(fā)現(xiàn)RBBP6可結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子ZBTB38，并靶向ZBTB38泛素化降解。RBBP6敲低引起的G2/M阻滯和DNA雙鏈斷裂損傷可被ZBTB38敲低所阻斷。由于RBBP6基因敲除小鼠胚胎致死，我們的研究將為尋找致死原因提供可分析的線索。
[Abstract]:HECT ubiquitin ligase (E3) plays an important role in bone homeostasis, tumorigenesis and viral infection, but the mechanism of its activity regulation is still unclear. The Nedd8 mediated ubiquitin modification is called Neddylation.. It is known that Neddylation modification is a necessary condition for the activation of Cullin-Ring class E3, but its relationship with HECT class E3 has not been reported. In this work, we found that the interaction of HECT ubiquitin ligase Smurf1 and ubiquitin like protein Nedd8. The protein stability and E3 activity of Smurf1 were regulated by ubiquitin like protein Nedd8, and the Neddylation modification ability of Nedd8 was regulated by Smurf1. Smurf1 could be modified by Nedd8 Neddylation. Especially in vitro, Smurf1 can catalyze Neddylation modification. In addition, Smurf1 can interact directly with Neddylation modified E2Ubc12, Smurf1 HECT N-lobe small subunit mediated interaction with Ubc12, Ubc12 N-terminal 1-26 amino acid residues. The active center H88-D89 of the middle core domain is necessary for the binding of Smurf1. The enzyme activity center modified by Smurf1 self-catalyzed Neddylation is C426. After this site mutation, Smurf1 will not be modified by Neddylation in vivo. The mutation of C426 in the catalytic domain of HECT has a direct effect on the degradation of Smurf1 to substrate, such as Smad5,RhoA, etc. It is also found that Smurf2 has similar effects and mechanisms as Smurf1. In this work, the functional association between HECT class E3 and ubiquitin modification was established for the first time in the world, and a new kind of HECT class E3 activity regulation mechanism was found. In order to identify more substrates of Smurf1 in order to expand its biological function, we used the WW domain of Smurf1 as bait and screened KLF2 as its binding protein by yeast two-hybrid technique. KLF2 belongs to Kr 眉 ppel like family protein member and is mainly involved in the normal development of lung. T cell differentiation and migration. In this work, we found that KLF2 in lung cancer cells is the target degradation substrate of Smurf1 in the nucleus. A series of Ubiquitin modification experiments showed that Smurf1 was the main Ubiquitin degradation of E3.Smurf1 in lung cancer cell H1299 and its transcription factor activity and its regulation on the downstream target genes CD62L and Wee1 were affected after the targeting degradation of KLF2 by Ubiquitin. In addition to the main work based on Smurf1, we found that ATM can phosphorylate the NuSAP, modification site of microtubule binding protein NuSAP S124. Both ATM phosphorylation modification and binding NuSAP occur in M phase. In addition, we also found that RBBP6 can bind to transcription inhibitor ZBTB38, and target ZBTB38 ubiquitin degradation. G 2 / M block and DNA double strand break damage induced by RBBP6 knockout can be blocked by ZBTB38 knockout. As RBBP6 knockout mouse embryos die, our research will provide analytical clues for finding the cause of death.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R341;Q55

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 林海燕,王紅梅,祝誠;泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路對Smad通路的調(diào)節(jié)[J];國外醫(yī)學(xué).分子生物學(xué)分冊;2003年04期

2 沈珊;郭興;盧克峰;張令強;范禮斌;;HECT類泛素連接酶Smurf1自身調(diào)控機制的研究[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年02期

3 王啟偉,樸英杰;Smad蛋白與TGF-β超家族[J];解剖科學(xué)進展;2003年04期

4 蔡瑜,沈錫中,王吉耀;四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過程中基因表達變化的研究[J];中華消化雜志;2003年10期

5 劉忠,郭樹忠,曹煜;TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究進展[J];中國美容醫(yī)學(xué);2004年04期

6 高中玉,林子豪,袁相斌;TGF-β基因表達調(diào)控的新進展[J];國外醫(yī)學(xué).生理.病理科學(xué)與臨床分冊;2004年03期

7 秦子敏;影響食管癌預(yù)后的因素[J];國外醫(yī)學(xué).腫瘤學(xué)分冊;2003年05期

8 王啟偉;Smad蛋白信號網(wǎng)絡(luò)[J];國外醫(yī)學(xué).分子生物學(xué)分冊;2003年04期

9 王連升,陳穎偉,李定國;TGFβ_1信號與肝纖維化[J];國外醫(yī)學(xué).消化系疾病分冊;2004年03期

10 盧朝輝,陳杰;Ski/SnoN蛋白與TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2003年02期

相關(guān)會議論文 前3條

1 楊壯智;陽韜;陳永平;林鐲;;SnoN蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的表達及其意義[A];第二十次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

2 陳大華;;The Niche-dependent feedback loop generates a BMP activity gradient to determine the germline stem cell fate[A];第二屆模式生物與人類健康研討會會議論文集[C];2012年

3 楊壯智;陽韜;陳永平;林鐲;;SnoN蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的表達及其意義[A];第四屆中國醫(yī)師協(xié)會感染科醫(yī)師大會暨傳染病診治高峰論壇、浙江省醫(yī)學(xué)會肝病、感染病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 評測工程師 秦鋼 李韜;主動的4到7層防御主動的[N];計算機世界;2004年

2 陳鏡波;美國紙品產(chǎn)量和消費量[N];中國包裝報;2003年

3 ;百兆防火墻[N];網(wǎng)絡(luò)世界;2002年

4 孫笑慶;DoS還是“老大難”[N];中國計算機報;2002年

5 ;網(wǎng)絡(luò)守護神[N];網(wǎng)絡(luò)世界;2003年

6 云飛;Cisco CSS阻斷DoS攻擊[N];中國計算機報;2001年

7 徐長城;華爾街與包裝[N];中國包裝報;2000年

8 趙關(guān)榮;打造六精防火墻[N];中國計算機報;2002年

9 ;魚與熊掌 亦可兼得[N];網(wǎng)絡(luò)世界;2004年

10 郎楷淳 編譯;賤賣雷諾阿[N];經(jīng)理日報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 謝萍;HECT類泛素連接酶Smurf1的Neddylation修飾研究[D];清華大學(xué);2011年

2 盧克峰;HECT類泛素連接酶Smurf1活性調(diào)控、新功能及相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

3 崔宇;SCF~(FBXL15)復(fù)合體促進HECT類泛素連接酶Smurf1的降解及其在BMP信號通路中的功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

4 郭興;HECT類泛素連接酶Smurf1對Wolfram綜合征致病分子WFS1穩(wěn)定性調(diào)控機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

5 黃永勝;RLIM增強TGF-β和BMP通路活性的機制研究及TGF-β基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性的Meta-分析[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

6 王亮;力學(xué)拉伸應(yīng)變對成骨細胞的影響及其作用機制的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

7 付曉;益氣解毒活絡(luò)法對早期糖尿病腎病大鼠TGF-Smads-UPP通路的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 沈珊;HECT類泛素連接酶Smurf1自身調(diào)控機制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

2 黃思斯;泛素連接酶Smurf1不同剪接異構(gòu)體的鑒定及功能研究[D];中南大學(xué);2012年

3 王藝芳;CKIP-1作為接頭蛋白偶聯(lián)Smurf1與蛋白酶體的相關(guān)研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2012年

4 吳敏;蛋白酶體激活因子REGγ與泛素連接酶Smurf1相互作用的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

5 王海龍;利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與果蠅smurf相互作用的蛋白[D];華南理工大學(xué);2010年

6 李穎;脂溢性角化病、基底細胞癌及鱗狀細胞癌中Ⅰ型和Ⅱ型TGFβ受體、Smad7、Smurf1和2的表達[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

7 羅嘉全;hMSCs成骨分化相關(guān)IncRNAs的篩選和鑒定[D];南昌大學(xué);2012年

本文編號：2326613