【摘要】：HECT類泛素連接酶（E3）在骨穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生、病毒感染等過程中發(fā)揮重要功能，但其活性調控機制還很不清楚。Nedd8介導的類泛素修飾稱為Neddylation。已知Neddylation修飾是Cullin-Ring類E3激活的必需條件，但其與HECT類E3的關系尚未見報道。本工作發(fā)現HECT類泛素連接酶Smurf1和類泛素蛋白Nedd8互作。Smurf1的蛋白穩(wěn)定性和E3活性受到類泛素蛋白Nedd8的調控，且調控依賴Nedd8的Neddylation修飾能力。Smurf1能夠被Nedd8進行Neddylation修飾，尤其在體外修飾體系中，Smurf1可以自我催化發(fā)生Neddylation修飾。另外，Smurf1可以與Neddylation修飾反應的E2Ubc12直接相互作用，Smurf1的HECT N-lobe小亞基介導與Ubc12相互作用，Ubc12的N末端1-26氨基酸殘基，及中部核心結構域的活性中心H88-D89是結合Smurf1所必須的。Smurf1自我催化Neddylation修飾的酶活中心是C426，這個位點突變后Smurf1在體內將不能發(fā)生Neddylation修飾。HECT催化結構域中的C426突變后直接影響Smurf1對底物，如Smad5、RhoA等的泛素化降解。研究中還發(fā)現Smurf2具有與Smurf1類似的效應與機制。本工作在國際上首次建立HECT類E3與類泛素修飾之間的功能關聯(lián)，且發(fā)現了一類新的HECT類E3活性調控機制。 為了鑒定Smurf1更多的底物以拓展它的生物學功能，我們以Smurf1的WW結構域為誘餌，，利用酵母雙雜交技術篩選到KLF2為其結合蛋白。KLF2屬于Krüppel樣家族蛋白成員，主要參與肺的正常發(fā)育，T細胞分化、遷移。本工作發(fā)現肺癌細胞中的KLF2為Smurf1在細胞核內的靶向降解底物。一系列泛素化修飾實驗表明在肺癌細胞H1299中Smurf1為KLF2主要的泛素化降解E3。Smurf1靶向降解KLF2后將影響其轉錄因子活性及其對下游靶基因CD62L和Wee1的調控。 除了以Smurf1為線索的主體工作外，我們揭示ATM可以磷酸化修飾微管結合蛋白NuSAP，修飾位點是NuSAP S124位點。ATM磷酸化修飾和結合NuSAP均發(fā)生于M期。此外，我們還發(fā)現RBBP6可結合轉錄抑制因子ZBTB38，并靶向ZBTB38泛素化降解。RBBP6敲低引起的G2/M阻滯和DNA雙鏈斷裂損傷可被ZBTB38敲低所阻斷。由于RBBP6基因敲除小鼠胚胎致死，我們的研究將為尋找致死原因提供可分析的線索。
[Abstract]:HECT ubiquitin ligase (E3) plays an important role in bone homeostasis, tumorigenesis and viral infection, but the mechanism of its activity regulation is still unclear. The Nedd8 mediated ubiquitin modification is called Neddylation.. It is known that Neddylation modification is a necessary condition for the activation of Cullin-Ring class E3, but its relationship with HECT class E3 has not been reported. In this work, we found that the interaction of HECT ubiquitin ligase Smurf1 and ubiquitin like protein Nedd8. The protein stability and E3 activity of Smurf1 were regulated by ubiquitin like protein Nedd8, and the Neddylation modification ability of Nedd8 was regulated by Smurf1. Smurf1 could be modified by Nedd8 Neddylation. Especially in vitro, Smurf1 can catalyze Neddylation modification. In addition, Smurf1 can interact directly with Neddylation modified E2Ubc12, Smurf1 HECT N-lobe small subunit mediated interaction with Ubc12, Ubc12 N-terminal 1-26 amino acid residues. The active center H88-D89 of the middle core domain is necessary for the binding of Smurf1. The enzyme activity center modified by Smurf1 self-catalyzed Neddylation is C426. After this site mutation, Smurf1 will not be modified by Neddylation in vivo. The mutation of C426 in the catalytic domain of HECT has a direct effect on the degradation of Smurf1 to substrate, such as Smad5,RhoA, etc. It is also found that Smurf2 has similar effects and mechanisms as Smurf1. In this work, the functional association between HECT class E3 and ubiquitin modification was established for the first time in the world, and a new kind of HECT class E3 activity regulation mechanism was found. In order to identify more substrates of Smurf1 in order to expand its biological function, we used the WW domain of Smurf1 as bait and screened KLF2 as its binding protein by yeast two-hybrid technique. KLF2 belongs to Kr 眉 ppel like family protein member and is mainly involved in the normal development of lung. T cell differentiation and migration. In this work, we found that KLF2 in lung cancer cells is the target degradation substrate of Smurf1 in the nucleus. A series of Ubiquitin modification experiments showed that Smurf1 was the main Ubiquitin degradation of E3.Smurf1 in lung cancer cell H1299 and its transcription factor activity and its regulation on the downstream target genes CD62L and Wee1 were affected after the targeting degradation of KLF2 by Ubiquitin. In addition to the main work based on Smurf1, we found that ATM can phosphorylate the NuSAP, modification site of microtubule binding protein NuSAP S124. Both ATM phosphorylation modification and binding NuSAP occur in M phase. In addition, we also found that RBBP6 can bind to transcription inhibitor ZBTB38, and target ZBTB38 ubiquitin degradation. G 2 / M block and DNA double strand break damage induced by RBBP6 knockout can be blocked by ZBTB38 knockout. As RBBP6 knockout mouse embryos die, our research will provide analytical clues for finding the cause of death.
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R341;Q55

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本文編號：2326612