【摘要】：研究背景腎移植經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,已成為目前治療終末期腎病的最有效手段。雖然腎移植取得了巨大成功,組織配型技術(shù)及新型免疫抑制劑的研發(fā)得到了長(zhǎng)足發(fā)展,腎移植患者術(shù)后仍面臨著急性排斥反應(yīng)(acute rejection, AR)的風(fēng)險(xiǎn)。AR的發(fā)生大大降低了移植物及受者的存活率,因此,及早診斷并治療AR顯得至關(guān)重要。目前臨床上診斷AR多依據(jù)臨床表現(xiàn)和生化指標(biāo)的改變,如血清肌酐水平上升、尿量減少、體重增加、發(fā)熱,或伴隨出現(xiàn)蛋白尿、血尿等,此時(shí)移植腎已出現(xiàn)病理改變,診斷滯后性顯而易見(jiàn)。程序性活檢能及時(shí)發(fā)現(xiàn)AR,但由于其屬有創(chuàng)性檢查,存在一定風(fēng)險(xiǎn)性,在我國(guó)尚未能被廣泛接受。新的血、尿標(biāo)記物如細(xì)胞間黏附分子21、IL-24、可溶性IL-22R及可溶性CD30等診斷AR多存在敏感性低或特異性不高等問(wèn)題。新型影像學(xué)技術(shù)如超聲造影及磁共振灌注加權(quán)成像(PWIMRI)等可以反映腎臟的形態(tài)和血流灌注,監(jiān)測(cè)排斥反應(yīng)的發(fā)生,但是同樣存在著滯后性的特點(diǎn)。細(xì)胞免疫應(yīng)答是介導(dǎo)移植腎排斥反應(yīng)的主要免疫學(xué)機(jī)制。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)和輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper, Th)17均為T淋巴細(xì)胞的亞群,二者在移植、自身免疫性疾病、炎癥性疾病及腫瘤等免疫相關(guān)性疾病中均扮演著重要角色。Treg在維持機(jī)體免疫平穩(wěn)、誘導(dǎo)免疫耐受方面起著重要作用。Thl7則能防御胞外病原菌的感染,介導(dǎo)炎性反應(yīng)及移植排斥反應(yīng)。Treg/Th17保持平衡,有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持,而如果Treg/Th17失衡,則會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生,在移植方面則可能引起排斥反應(yīng)的發(fā)生。因此,我們期待通過(guò)檢測(cè)外周血Treg/Th17平衡的變化,來(lái)找尋一種簡(jiǎn)便、有效、無(wú)創(chuàng)而又特異性地預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)發(fā)生的方法。MicroRNAs (miRNAs)是一類近10年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子,從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),在生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用。miRNAs效應(yīng)分子參與了免疫反應(yīng)的各個(gè)階段,與T、B細(xì)胞的分化發(fā)育及B細(xì)胞抗體的類別轉(zhuǎn)換密切相關(guān),具有免疫調(diào)控的作用。miRNAs與AR的發(fā)生存在密切聯(lián)系。來(lái)自紐約威爾康奈爾醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)生AR的移植腎穿刺活檢組織中存在著miR-142-5p、miR-155和miR-223等的高表達(dá),提示腎穿刺組織miRNAs的變化可以反映急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。因此,我們想到血液中miRNAs的變化亦有可能預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,并且這種檢測(cè)是無(wú)創(chuàng)的。皮膚移植是目前可行的器官移植中排斥反應(yīng)最為強(qiáng)烈的模型,因觀察周期短、操作簡(jiǎn)便、手術(shù)成功率高、可控性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于移植模型的建立。我們根據(jù)國(guó)內(nèi)外關(guān)于皮膚移植的文獻(xiàn)報(bào)道,選擇移植物存活率較高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的方法制作研究所需的小鼠皮膚移植模型,并通過(guò)檢測(cè)不同類型小鼠皮膚移植模型中Treg/Th17平衡及miRNAs的變化,來(lái)探索尋找無(wú)創(chuàng)檢測(cè)AR的特異性生物學(xué)標(biāo)記物。目的1.建立小鼠皮膚移植模型。2.研究不同類型小鼠皮膚移植模型中外周血Treg/Th17平衡的變化。3.探討血液中miRNAs在不同類型小鼠皮膚移植模型的表達(dá)水平變化。方法1.建立小鼠背對(duì)背皮膚移植模型a)動(dòng)物分組受者Balb/c小鼠60只,按照體重、年齡和性別相同的情況,隨機(jī)分為三個(gè)大組：自體移植組(對(duì)照組)、同種異基因移植組(急性排斥組)和環(huán)孢素組(CsA組),每組20只。其中對(duì)照組行Balb/c小鼠背部皮膚的自體移植；急性排斥組以C57BL/6為供者小鼠行同種異基因皮膚移植；環(huán)孢素組亦以C57BL/6為供者小鼠行同種異基因皮膚移植,并從手術(shù)當(dāng)天開(kāi)始每天腹腔注射環(huán)孢素A (20mg/Kg·d)。對(duì)照組和急性排斥組從手術(shù)當(dāng)天開(kāi)始每天腹腔注射等量0.9%生理鹽水作為對(duì)照。b)皮膚移植移植物為供者的背部皮膚,移植床為受者的背部。供受者小鼠麻醉后準(zhǔn)備移植皮片和移植床,對(duì)合完畢,將背部皮片采用6-8針間斷縫合固定在受者小鼠背部,凡士林紗布和無(wú)菌紗布覆蓋,創(chuàng)可貼加壓包扎。c)術(shù)后觀察在行移植術(shù)后第7天拆除繃帶,觀察移植皮片存活情況,用皮片平均存活時(shí)間(mean survival time, MS T)表示。若植皮與宿主的背底部愈合,色澤一致,無(wú)炎癥和充血,有毛的皮膚毛發(fā)生長(zhǎng)良好,則認(rèn)為未發(fā)生排斥反應(yīng)。移植皮片發(fā)黑,發(fā)干,結(jié)痂,皺縮等為移植皮片發(fā)生排斥反應(yīng)的表現(xiàn)。當(dāng)小鼠移植皮片有發(fā)生排斥反應(yīng)的表現(xiàn),而且排斥面積占小鼠移植皮片總面積的百分比80%,視為完全排斥。2.研究不同類型小鼠皮膚移植模型中外周血Treg/Th17平衡的變化a)動(dòng)物分組受者Balb/c小鼠30只,按照體重、年齡和性別相同的情況,隨機(jī)分為三個(gè)大組：自體移植組(對(duì)照組)、同種異基因移植組(急性排斥反應(yīng)組)和環(huán)孢素組(CsA組),每組10只。各組處理同前。b)皮膚移植：具體方法同前。c)外周血Treg/Th17的檢測(cè)分別在皮膚移植術(shù)前及術(shù)后第1天、第3天、第7天經(jīng)小鼠眼內(nèi)眥靜脈采血100μ1,肝素抗凝,加入全培溶液、佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)及Golgistop,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)6h,加入FITC Rat Anti-MouseCD4,避光孵育30min,然后行固定打孔,再加入Alexa Fluro 647 Rat Anti-Mouse Foxp3和PE Rat Anti-Mouse IL-17A避光孵育30min,行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。3.探討血液中miRNAs在不同類型小鼠皮膚移植模型的表達(dá)水平變化a)動(dòng)物分組：受者Balb/c小鼠36只,按照體重、年齡和性別相同的情況,隨機(jī)分為三個(gè)大組：自體移植組(對(duì)照組)、同種異基因移植組(急性排斥反應(yīng)組)和環(huán)孢素組(CsA組),每組12只。各組處理同前。b)皮膚移植：具體方法同前。c)血液中miRNAs的檢測(cè)：分別于術(shù)前(day 0)、術(shù)后第一天(day 1)、術(shù)后第三天(day 3)及術(shù)后第七天(day 7)每組隨機(jī)抽取3只小鼠,每只小鼠行心臟采血1ml左右,然后予以處死,血液樣本采用EDTA抗凝,-20-C保存。采用miRNA提取試劑盒提取RNA,行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),然后采用熒光定量PCR法檢測(cè)mir-142-5p、mir-155及mir-223的表達(dá)量。根據(jù)樣本擴(kuò)增曲線圖和融解曲線圖,測(cè)量熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)(Ct值),所得數(shù)據(jù)采用2-△△ct法進(jìn)行分析。4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。小鼠皮片生存分析采用近似時(shí)序檢驗(yàn)(Log-Rank檢驗(yàn)),乘積極限法(Kaplan-Meier法)做生存曲線。單因素的組間比較采用單向方差分析,重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,析因設(shè)計(jì)資料的組間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析,多重比較時(shí)若滿足方差齊性采用Bonferroni法,若方差不齊采用Dunnett'sT3法。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.三組小鼠移植皮片存活狀況三組小鼠在移植術(shù)后7天拆除繃帶后,均無(wú)皮片移位和脫落現(xiàn)象。對(duì)照組、急性排斥組和環(huán)孢素組的中位生存時(shí)間分別為大于30天、8天、20天。對(duì)照組(自體皮膚移植組)20例移植皮片有18例存活時(shí)間大于30天,移植皮片的存活率為90%。三組小鼠間皮片生存時(shí)間比較有顯著性差異(P=0.000),對(duì)照組存活時(shí)間較急性排斥組和環(huán)孢素組明顯延長(zhǎng)(χ2=39.112,P=0.000；χ2=15.898,P=0.000),環(huán)孢素組較急性排斥組亦明顯延長(zhǎng)(χ2=35.786,P=0.000)。2.三組小鼠不同時(shí)間外周血Treg/Th17平衡的變化不同組間Treg/CD4+T細(xì)胞比例沒(méi)有顯著性差異(F=1.987,P=0.157)；不同時(shí)間之間的Treg/CD4+T細(xì)胞比例亦沒(méi)有顯著性差異(F=1.109,P=0.350)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)亦不顯著(F=0.221,P=0.969)。不同組間Th17/CD4+T細(xì)胞比例沒(méi)有顯著性差異(F=0.513,P=0.605)；不同時(shí)間之間的Th17/CD4+T細(xì)胞比例亦沒(méi)有顯著性差異(F=1.367,P=0.259)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)亦不顯著(F=0.188,P=0.979)。不同組間Treg/Th17比例沒(méi)有顯著性差異(F=0.890,P=0.422)；不同時(shí)間之間的Treg/Th17比例亦沒(méi)有顯著性差異(F=0.374,P=0.772)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)亦不顯著(F=0.087,P=0.997)。3. 三組小鼠不同時(shí)間血液中三種miRNA的變化不同組間mir-142-5p的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=15.185,P=0.000)；不同時(shí)間之間的mir-142-5p的相對(duì)表達(dá)水平亦有顯著性差異(F=44.018,P=0.000)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)顯著(F=7.709,P=0.000)。在術(shù)后第三天(day3),三組間mir-142-5p的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=26.490,P=0.001)。急性排斥組較對(duì)照組和環(huán)孢素組顯著升高(P=0.002,P=0.003),而環(huán)孢素組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P=1.000)。不同組間mir-155的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=9.876,P=0.001)；不同時(shí)間之間的mir-155的相對(duì)表達(dá)水平亦有顯著性差異(F=11.228,P=0.000)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)不顯著(F=1.924,P=0.118)。在術(shù)后第七天(day7),三組間mir-155的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=8.002,P=0.020)。急性排斥組較對(duì)照組顯著升高(P=0.022),與環(huán)孢素組之間則無(wú)顯著性差異(P=0.387),環(huán)孢素組與對(duì)照組之間亦無(wú)明顯差異(P=0.201)。不同組間mir-223的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(F=1.196,P=0.320)；而不同時(shí)間之間的mir-223的相對(duì)表達(dá)水平有顯著性差異(F=13.792,P=0.000)；組別與時(shí)間之間的交互效應(yīng)不顯著(F=0.408,P=0.867)。結(jié)論1.小鼠外周血Treg、Th17及Treg/Th17在皮膚移植急性排斥反應(yīng)早期未有明顯變化,Treg/Th17平衡不能用于小鼠急性排斥反應(yīng)的早期預(yù)測(cè)。2.小鼠血液中mir-142-5p和mir-155在皮膚移植急性排斥反應(yīng)早期表達(dá)升高,可以用于小鼠急性排斥反應(yīng)的早期預(yù)測(cè)。3.小鼠血液中mir-223在皮膚移植急性排斥反應(yīng)早期未有明顯升高,不能用于小鼠急性排斥反應(yīng)的早期預(yù)測(cè)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R622.1;R-332

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本文編號(hào)：2323742