【摘要】：結核炳(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染疾病。全球約有1/3的人口感染了結核,且每年的新增病例約有900萬,并約有200萬的死亡病例。而在過去的三十年間,人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的感染與結核病的流行越來越息息相關。全球約有1400萬人共感染了Mtb和HIV。HIV的感染是導致潛伏性結核感染發(fā)展為活動性結核病的最重要原因,使?jié)摲越Y核20-30倍更多的可能發(fā)展為活動性結核。同時Mtb也是導致艾滋病死亡的最重要原因之一,約占艾滋死亡人數(shù)的四分之一。在同一個宿主內,這兩種病原體,Mtb與HIV,相互間起著協(xié)同作用,可以互相促進彼此在體內的復制及致病性,能夠加速宿主免疫功能的衰退并導致宿主死亡。另外由于兩種病原體共感染的復雜性給疾病的診斷及有效治療也提出了嚴峻的挑戰(zhàn),尤其對那些有大量共感染人群的國家如非洲及亞洲的許多國家的衛(wèi)生保健系統(tǒng)產(chǎn)生了巨大壓力。目前最經(jīng)濟有效的防控方法便是采用疫苗。然而,目前唯一批準人類使用的結核疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)并不能有效的預防成人中最常見形式的結核病——肺結核,并且也不能阻止Mtb的傳播。同樣地,盡管已經(jīng)有一些HIV候選疫苗正在進行臨床試驗的評估,但到目前為止仍然沒有批準有效的預防性HIV疫苗。因此,研制一個有效的疫苗使其能在抗結核的同時還具有抗HIV的免疫原性是十分必要的。 機體在抗結核的過程中主要是通過T細胞免疫應答。因此選用能夠誘導T細胞應答的T細胞表位是一種理想的疫苗設計方式。選擇性將多個強免疫原性T細胞表位應用于一個疫苗中不僅能夠誘導更廣泛更強烈的T細胞應答,還能避免由抗原中其他不利成分引起的不良反應或逃逸作用。然而表位作為短肽單獨使用時免疫原性低,需要連接于載體蛋白。傳統(tǒng)的方式是將表位直接進行串聯(lián)連接于載體蛋白,但這種方式被證明不能全面誘導每個表位的特異性應答。本研究通過將表位構鑄到載體蛋白的不同區(qū)域中以期保持各表位的強免疫原性。以往的研究證明天然結構蛋白是理想的載體蛋白。p24蛋白是HIV-1的一個免疫優(yōu)勢抗原,能夠誘導強烈的體液及細胞免疫應答。有效的抗HIV-1免疫應答主要就是通過體液及細胞免疫應答兩者的相輔相成作用。因此本研究通過將p24蛋白作為插入結核表位的載體蛋白,構建得到一個同時抗Mtb/HIV-1的疫苗pP24-Mtb。通過將pP24-Mtb質粒免疫小鼠,檢測誘導的特異性免疫應答及免疫保護力,獲得了以下結果： 一、新型DNA疫苗pP24-Mtb的分子設計及構建表達 根據(jù)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫及相關文獻報道,我們選擇從MPT64、Ag85A、Ag85B及TB10.4四個結核優(yōu)勢抗原中選擇T細胞表位,再通過表位預測軟件確定MPT6476-84、Ag85A242-250、Ag85B184-192、TB10.474-82四條功能性T細胞表位作為疫苗所要插入的結核表位。另外根據(jù)相關文獻確定以HIV-1p24優(yōu)勢抗原作為插入結核表位的載體蛋白。根據(jù)蛋白空間結構預測軟件得到p24蛋白的二級和三級結構,并結合文獻分析確定最終的插入位置,即：在p24N端laa之前插入MPT6476-84表位；在91aa之后插入Ag85A242-250表位；在101aa之后插入Ag85B]84-192表位；在147aa之后插入TB10.474-82表位。 根據(jù)以上設計方案,構建疫苗pcDNA3.1-P24-Mtb及各對照質粒。首先以pET11a-P24為模板,經(jīng)PCR擴增出p24基因片段,經(jīng)酶切定向插入到真核表達載體pcDNA3.1中,構建得到重組表達質粒pcDNA3.1-P24。為了構建pcDNA3.1-P24-Mtb質粒,我們設計了包含有4條結核分枝桿菌T細胞表位并且相互間有重疊互補序列的各條p24特異性引物,以pcDNA3.1-P24質粒為模板,通過基因重疊延伸拼接PCR技術得到最終的p24-Mtb基因片段。經(jīng)過同樣的酶切步驟定向連接于pcDNA3.1中,得到pP24-Mtb DNA疫苗。通過PCR、特異性雙酶切及測序鑒定所構建質粒正確。為分析質粒的體外表達情況,將p24及p24-Mtb基因片段經(jīng)雙酶切后克隆至pET32a質粒中,經(jīng)IPTG體外誘導表達并經(jīng)親和層析純化柱得到純度超過80%的蛋白。純化蛋白經(jīng)Western Blot鑒定,均能和小鼠抗p24抗體結合,證明了質粒的正確表達也說明了其空間結構的完整性。 二、 pP24-Mtb疫苗中結核表位的免疫反應性研究 以往的研究發(fā)現(xiàn)疫苗中將表位直接串聯(lián)的方式并不能使每個表位都發(fā)揮作用,為了對比串聯(lián)表位方式與pP24-Mtb構鑄表位方式的優(yōu)越性,我們構建了表位串聯(lián)對照質粒pP24pep,即將四個結核表位串聯(lián)后連接于p24蛋白的C末端。同樣以pP24質粒為模板,通過基因重疊延伸拼接PCR技術得到p24pep基因片段,經(jīng)酶切連接入pcDNA3.1中。將pP24-Mtb、pP24pep及pcDNA3.1(vector)三種質粒分別肌肉免疫BALB/c小鼠,隔周免疫,共4次。于末次免疫后2周取脾臟淋巴細胞從特異性增殖反應、IFN-y生成細胞、CTL應答及細胞因子的分泌水平等方面分析了各組中表位的反應差異性。 1)首先我們檢測了淋巴細胞針對四個混合結核表位肽產(chǎn)生的特異性細胞免疫應答,發(fā)現(xiàn)與vector空質粒組相比,pP24-Mtb與pP24pep免疫后均可以產(chǎn)生較高水平的混合表位肽特異性的增殖反應、產(chǎn)生大量的IFN-γ分泌細胞、誘導較強的CTL殺傷應答并分泌大量的Thl型細胞因子(IFN-γ、TNF-α),然而pP24-Mtb組與pP24pep組間并無顯著差異,提示pP24-Mtb、pP24pep免疫均可以促進針對混合表位肽特異性的細胞免疫應答。 2)為了進一步探討兩質粒對各表位免疫原性展現(xiàn)的差異性,我們在體外用每一個單表位肽進行刺激,結果發(fā)現(xiàn)：pP24-Mtb免疫組對四個表位肽均可以產(chǎn)生特異性增殖反應,而與之相比,pP24pep免疫組僅可以產(chǎn)生Ag85A242-250和Ag85B184-192表位特異性增殖反應,而對MPT6476-84和TB10.474-82表位則沒有。另外pP24-Mtb組還可以產(chǎn)生每個表位特異性的IFN-γ分泌細胞,而pP24pep組僅能產(chǎn)生針對Ag85A242-250和Ag85B184-192表位的IFN-γ分泌細胞,而對MPT6476-84和TB10.474-82表位的應答則遠弱于pP24-Mtb組。同樣,pP24-Mtb組可以誘導較強的四個單表位特異性CTL殺傷率及Thl型細胞因子,而pP24pep組則僅對兩個表位產(chǎn)生較強的應答。因此提示pP24-Mtb質�？梢员３置總�表位的強免疫原性,使每個表位都能產(chǎn)生相應的特異性免疫應答,而pP24pep質粒僅能保持其中兩個表位發(fā)揮作用。 3)在此基礎上,為了進一步模擬天然感染狀態(tài)時兩種質粒中表位的反應差異性,我們采用熱滅活的BCG (HK BCG)體外刺激脾細胞,結果發(fā)現(xiàn)pP24-Mtb免疫組可以產(chǎn)生顯著高于pP24pep免疫組的增殖反應。另外,pP24-Mtb組經(jīng)HKBCG刺激后能夠產(chǎn)生大量的IFN-γ分泌細胞,顯著高于pP24pep組。同樣pP24-Mtb免疫組還可以誘導高水平的HK BCG特異性CTL殺傷率及Thl型細胞因子,遠高于pP24pep免疫組。 因此通過上述研究我們發(fā)現(xiàn),將表位構鑄到載體蛋白不同區(qū)域中的疫苗構建方式相比傳統(tǒng)的將表位串聯(lián)的構建方式更能維持每個表位的強免疫原性,從而誘生每個表位特異的免疫應答,避免出現(xiàn)表位功能喪失的現(xiàn)象而使應答不全面。另外表位構鑄的方式使表位更接近于其在天然抗原中的存在形式,從而在滅活菌刺激下誘導更為強烈的免疫應答,且這種應答更接近于機體天然感染狀態(tài)時產(chǎn)生的應答,因此可能介導更為有效的保護作用。在接下來的研究工作中,我們將探討該疫苗誘導的特異性免疫應答及免疫保護作用。 三、 pP24-Mtb疫苗誘導的特異性免疫應答及免疫保護作用研究 分別以pP24-Mtb, pP24, pcDNA3.1(vector)肌肉免疫小鼠,隔周免疫,共4次。BCG經(jīng)皮下免疫5×105CFU,僅一次。隔周收集小鼠血清。從誘導的Mtb及HIV-1特異性體液及細胞免疫應答的各個方面進行了檢測分析,結果發(fā)現(xiàn)： 1)在體液免疫應答方面,因為選擇的是結核T細胞表位,因此疫苗并不能產(chǎn)生結核特異性抗體,我們重點關注了HIV-1特異性抗體的產(chǎn)生。pP24-Mtb可以顯著提高血清p24特異性IgG抗體的滴度,第10周達到高峰,滴度達到1：4000,顯著高于同期pP24疫苗組(1：2250)。更有意義的是,pP24-Mtb免疫促進了抗體親合力成熟,誘生了高親合力抗體的產(chǎn)生。高水平高質量的抗體對于有效預防HIV-1感染和清除病毒極為重要。 2)在細胞免疫應答方面,我們首先檢測了疫苗誘導的結核及HIV-1特異性淋巴細胞增殖反應,發(fā)現(xiàn)pP24-Mtb免疫后可以產(chǎn)生高水平的結核特異性增殖反應,并且與BCG免疫組的應答無顯著差異。同時,pP24-Mtb疫苗還可以產(chǎn)生強烈的p24特異性增殖反應,增殖指數(shù)達到3.7。提示pP24-Mtb疫苗不僅能夠產(chǎn)生結核特異性的細胞增殖反應,還可以促進HIV-1特異性的淋巴細胞增殖功能。 3)特異性IFN-γ分泌細胞檢測發(fā)現(xiàn)：pP24-Mtb免疫組可以產(chǎn)生大量的結核特異性IFN-γ分泌細胞,并與BCG的IFN-γ分泌細胞頻率相似。另外,與pP24組相比,pP24-Mtb免疫小鼠能夠產(chǎn)生更多的p24特異性的IFN-γ生成細胞。提示pP24-Mtb疫苗能夠促進產(chǎn)生結核及HIV-1特異性的IFN-γ分泌細胞。我們進一步檢測了分泌IFN-γ的淋巴細胞亞群比例,pP24-Mtb免疫后CD4+IFN-γ+T細胞與CD8+IFN-γ+T細胞比例都顯著高于vector空質粒組,與BCG免疫組相似。另外,pP24-Mtb組同時還能促進p24特異性CD4+/CD8+IFN-γ+T淋巴細胞的產(chǎn)生。結果說明pP24-Mtb疫苗能夠促進機體產(chǎn)生結核及HIV-1特異性的Th1型應答并提示能夠產(chǎn)生CD8+CTL應答。 4)特異性CTL活性檢測發(fā)現(xiàn)：pP24-Mtb免疫小鼠的淋巴細胞有更高水平的結核特異性CTL殺傷率,與BCG組相似,達到50%。與此同時,pP24-Mtb還能產(chǎn)生強烈的p24特異性CTL殺傷率,并顯著高于pP24組。進一步證明了pP24-Mtb免疫能夠同時增強結核及HIV-1特異性CTL應答。 5)特異性細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)：pP24-Mtb疫苗能夠誘導大量結核特異性的Thl型細胞因子的表達(IFN-γ、TNF-α),而Th2型細胞因子(IL-4、IL-10)的表達水平非常低。此外,pP24-Mtb免疫組與pP24免疫組相比,可以誘生更高水平的p24特異性Thl型細胞因子,而Th2型細胞因子的水平也非常低。進一步證明pP24-Mtb免疫后能夠同時促進結核及HIV-1特異性細胞免疫應答向Th1型偏移。 pP24-Mtb疫苗成功誘導了強烈的抗結核T細胞免疫應答,并且其應答強度與BCG無顯著差異,提示其誘導的特異性免疫應答可以介導有效的保護作用。我們通過建立小鼠結核感染模型評價了該疫苗的抗結核保護效果,結果顯示： 1)與vector對照組相比,pP24-Mtb可以顯著減少小鼠肺臟及脾臟中的結核菌落數(shù),并且與BCG免疫組減少菌落數(shù)的水平相當,沒有顯著差異。提示pP24-Mtb疫苗能夠有效抑制感染的結核菌在局部及系統(tǒng)性組織中的復制,并且達到與BCG疫苗相似的水平。 2)在觀察感染部位肺臟中結核所致的病理損傷情況時發(fā)現(xiàn),在pP24和vector對照小鼠肺組織中有明顯的炎性細胞浸潤以及類肉芽腫樣病變,正常的肺泡結構被破壞,炎癥范圍分別達到60%和75%。而在pP24-Mtb和BCG免疫組,僅見少量炎性細胞浸潤,且肺泡結構無明顯異常,與正常對照組接近。進一步證明pP24-Mtb疫苗能夠產(chǎn)生有效的抗結核保護效果,抵抗結核感染,并且其保護效果與BCG疫苗相似。 本研究通過將強免疫原性的結核T細胞表位構鑄到HIV-1p24蛋白的不同區(qū)域中構建得到新型DNA疫苗pP24-Mtb。觀察了其與傳統(tǒng)表位構建方式相比的構建合理性與優(yōu)越性,其能使每個表位都誘導更接近于天然感染狀態(tài)時產(chǎn)生的特異性免疫應答。在分析誘導的結核及HIV-1特異性免疫應答時確定了pP24-Mtb疫苗能夠同時誘生全面有效的抗結核及抗HIV-1免疫應答。并且證明了該疫苗在結核感染后展現(xiàn)了有效的保護作用。本研究為抗共感染疫苗的分子設計提供了新的思路和技術平臺。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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