【摘要】：LIM同源盒基因8（LIM homeobox8, Lhx8）與胚胎基底前腦膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育有關(guān)，但Lhx8在中樞膽堿能神經(jīng)再生及海馬齒狀回膽堿能神經(jīng)再生過(guò)程中所起的作用尚未見(jiàn)到報(bào)道，本研究主要探討Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生中所起的作用。 一．目的： 體外培養(yǎng)大鼠海馬源性放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（Radial glia cells, RGCs），觀察并檢測(cè)海馬提取液在RGCs增殖和向膽堿能神經(jīng)元分化過(guò)程中所發(fā)揮的效用；構(gòu)建Lhx8過(guò)表達(dá)載體并經(jīng)慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的RGCs，同時(shí)注入大鼠海馬齒狀回中，對(duì)Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生過(guò)程中所起的作用進(jìn)行初步的探討。 二．方法： （1）切割大鼠右側(cè)穹窿海馬傘并且制備正常側(cè)及切割側(cè)海馬提取液； （2）體外培養(yǎng)海馬源性RGCs，在培養(yǎng)液中加入正常側(cè)及切割側(cè)海馬提取液，觀察海馬提取液對(duì)RGCs增殖和向神經(jīng)元分化方面的作用； （3）聯(lián)合應(yīng)用海馬提取液及NGF共同促進(jìn)海馬RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化，觀察Lhx8在ChAT陽(yáng)性的神經(jīng)元中的表達(dá)和定位； （4）克隆Lhx8cDNA序列，構(gòu)建pLenti6.3-Lhx8-IRES2-EGFP表達(dá)載體并經(jīng)慢病毒包裝，將收集的慢病毒Lenti6.3-Lhx8轉(zhuǎn)染RGCs，觀察RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化的情況，檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)變化； （5）將慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入正常側(cè)及切割穹窿海馬傘側(cè)大鼠海馬齒狀回中，觀察正常側(cè)及切割側(cè)海馬齒狀回中ChAT陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元的表達(dá)和定位，檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)變化。 三．結(jié)果： （1） RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)可表達(dá)膠質(zhì)相關(guān)標(biāo)記物BLBP、GFAP、Vimentin，，并且這些膠質(zhì)相關(guān)標(biāo)記物能與干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物Nestin進(jìn)行雙標(biāo)，此外RGCs還能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞； （2）切割穹窿海馬傘側(cè)的海馬提取液能夠明顯促進(jìn)RGCs的增殖和向神經(jīng)元分化；切割側(cè)海馬提取液聯(lián)合NGF能夠促進(jìn)RGCs向ChAT陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元分化，這些ChAT陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元能夠表達(dá)Lhx8； （3） RGCs轉(zhuǎn)染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，分化為MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元的總體數(shù)目沒(méi)有明顯增加，但是能夠提高ChAT陽(yáng)性細(xì)胞在MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元中所占的比例，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯增高，說(shuō)明轉(zhuǎn)染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠促進(jìn)RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化； （4）在正常海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠明顯提高齒狀回內(nèi)ChAT/Lhx8陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量；切割穹窿海馬傘并聯(lián)合慢病毒注射后，發(fā)現(xiàn)齒狀回內(nèi)ChAT/Lhx8陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量增加更為明顯，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯增高，說(shuō)明切割穹窿海馬傘并且聯(lián)合應(yīng)用Lenti6.3-Lhx8慢病毒可以明顯地促進(jìn)海馬內(nèi)的膽堿能神經(jīng)再生水平。 四．結(jié)論： （1）體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學(xué)特征，這些細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物。體外應(yīng)用切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液能夠較好的模擬切割穹窿海馬傘后的海馬再生微環(huán)境。在RGCs擴(kuò)增培養(yǎng)階段切割側(cè)海馬提取液能明顯地促進(jìn)RGCs增殖，而在RGCs分化階段切割側(cè)海馬提取液也能夠促進(jìn)RGCs更多地向神經(jīng)元分化； （2）慢病毒Lenti6.3-Lhx8能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化，但對(duì)RGCs分化產(chǎn)生的神經(jīng)元總體數(shù)量沒(méi)有影響。Lhx8作為L(zhǎng)IM同源盒基因家族成員，僅在神經(jīng)元膽堿能表型確立方面起到作用，而不能促進(jìn)體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs更多地向神經(jīng)元分化； （3）慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入海馬齒狀回后，齒狀回ChAT陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量與正常海馬比較明顯增多。在切割穹窿海馬傘側(cè)的海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，發(fā)現(xiàn)ChAT陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量增加更為明顯，說(shuō)明LIM同源盒基因家族成員Lhx8在切割穹窿海馬傘后的海馬膽堿能神經(jīng)再生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R321

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2312745