發(fā)布時間：2018-11-05 17:13

【摘要】：LIM同源盒基因8（LIM homeobox8, Lhx8）與胚胎基底前腦膽堿能神經元的發(fā)育有關，但Lhx8在中樞膽堿能神經再生及海馬齒狀回膽堿能神經再生過程中所起的作用尚未見到報道，本研究主要探討Lhx8在海馬膽堿能神經再生中所起的作用。 一．目的： 體外培養(yǎng)大鼠海馬源性放射狀膠質細胞（Radial glia cells, RGCs），觀察并檢測海馬提取液在RGCs增殖和向膽堿能神經元分化過程中所發(fā)揮的效用；構建Lhx8過表達載體并經慢病毒包裝，轉染至體外培養(yǎng)的RGCs，同時注入大鼠海馬齒狀回中，對Lhx8在海馬膽堿能神經再生過程中所起的作用進行初步的探討。 二．方法： （1）切割大鼠右側穹窿海馬傘并且制備正常側及切割側海馬提取液； （2）體外培養(yǎng)海馬源性RGCs，在培養(yǎng)液中加入正常側及切割側海馬提取液，觀察海馬提取液對RGCs增殖和向神經元分化方面的作用； （3）聯(lián)合應用海馬提取液及NGF共同促進海馬RGCs向膽堿能神經元分化，觀察Lhx8在ChAT陽性的神經元中的表達和定位； （4）克隆Lhx8cDNA序列，構建pLenti6.3-Lhx8-IRES2-EGFP表達載體并經慢病毒包裝，將收集的慢病毒Lenti6.3-Lhx8轉染RGCs，觀察RGCs向膽堿能神經元分化的情況，檢測Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達變化； （5）將慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入正常側及切割穹窿海馬傘側大鼠海馬齒狀回中，觀察正常側及切割側海馬齒狀回中ChAT陽性的膽堿能神經元的表達和定位，檢測Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達變化。 三．結果： （1） RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學特征，同時可表達膠質相關標記物BLBP、GFAP、Vimentin，，并且這些膠質相關標記物能與干細胞相關標記物Nestin進行雙標，此外RGCs還能夠分化為神經元、星形膠質細胞以及少突膠質細胞； （2）切割穹窿海馬傘側的海馬提取液能夠明顯促進RGCs的增殖和向神經元分化；切割側海馬提取液聯(lián)合NGF能夠促進RGCs向ChAT陽性的膽堿能神經元分化，這些ChAT陽性的膽堿能神經元能夠表達Lhx8； （3） RGCs轉染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，分化為MAP2陽性神經元的總體數(shù)目沒有明顯增加，但是能夠提高ChAT陽性細胞在MAP2陽性神經元中所占的比例，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達量也明顯增高，說明轉染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠促進RGCs向膽堿能神經元分化； （4）在正常海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠明顯提高齒狀回內ChAT/Lhx8陽性的膽堿能神經元數(shù)量；切割穹窿海馬傘并聯(lián)合慢病毒注射后，發(fā)現(xiàn)齒狀回內ChAT/Lhx8陽性的膽堿能神經元的數(shù)量增加更為明顯，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達量也明顯增高，說明切割穹窿海馬傘并且聯(lián)合應用Lenti6.3-Lhx8慢病毒可以明顯地促進海馬內的膽堿能神經再生水平。 四．結論： （1）體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學特征，這些細胞能夠同時表達膠質細胞相關標記物和干細胞相關標記物。體外應用切割穹窿海馬傘側海馬提取液能夠較好的模擬切割穹窿海馬傘后的海馬再生微環(huán)境。在RGCs擴增培養(yǎng)階段切割側海馬提取液能明顯地促進RGCs增殖，而在RGCs分化階段切割側海馬提取液也能夠促進RGCs更多地向神經元分化； （2）慢病毒Lenti6.3-Lhx8能夠促進體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs向膽堿能神經元分化，但對RGCs分化產生的神經元總體數(shù)量沒有影響。Lhx8作為LIM同源盒基因家族成員，僅在神經元膽堿能表型確立方面起到作用，而不能促進體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs更多地向神經元分化； （3）慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入海馬齒狀回后，齒狀回ChAT陽性膽堿能神經元的數(shù)量與正常海馬比較明顯增多。在切割穹窿海馬傘側的海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，發(fā)現(xiàn)ChAT陽性的神經元數(shù)量增加更為明顯，說明LIM同源盒基因家族成員Lhx8在切割穹窿海馬傘后的海馬膽堿能神經再生過程中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R321

【共引文獻】

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本文編號：2312745