【摘要】：LIM同源盒基因8（LIM homeobox8, Lhx8）與胚胎基底前腦膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育有關(guān)，但Lhx8在中樞膽堿能神經(jīng)再生及海馬齒狀回膽堿能神經(jīng)再生過程中所起的作用尚未見到報道，本研究主要探討Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生中所起的作用。 一．目的： 體外培養(yǎng)大鼠海馬源性放射狀膠質(zhì)細胞（Radial glia cells, RGCs），觀察并檢測海馬提取液在RGCs增殖和向膽堿能神經(jīng)元分化過程中所發(fā)揮的效用；構(gòu)建Lhx8過表達載體并經(jīng)慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的RGCs，同時注入大鼠海馬齒狀回中，對Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生過程中所起的作用進行初步的探討。 二．方法： （1）切割大鼠右側(cè)穹窿海馬傘并且制備正常側(cè)及切割側(cè)海馬提取液； （2）體外培養(yǎng)海馬源性RGCs，在培養(yǎng)液中加入正常側(cè)及切割側(cè)海馬提取液，觀察海馬提取液對RGCs增殖和向神經(jīng)元分化方面的作用； （3）聯(lián)合應用海馬提取液及NGF共同促進海馬RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化，觀察Lhx8在ChAT陽性的神經(jīng)元中的表達和定位； （4）克隆Lhx8cDNA序列，構(gòu)建pLenti6.3-Lhx8-IRES2-EGFP表達載體并經(jīng)慢病毒包裝，將收集的慢病毒Lenti6.3-Lhx8轉(zhuǎn)染RGCs，觀察RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化的情況，檢測Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達變化； （5）將慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入正常側(cè)及切割穹窿海馬傘側(cè)大鼠海馬齒狀回中，觀察正常側(cè)及切割側(cè)海馬齒狀回中ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元的表達和定位，檢測Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達變化。 三．結(jié)果： （1） RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學特征，同時可表達膠質(zhì)相關(guān)標記物BLBP、GFAP、Vimentin，并且這些膠質(zhì)相關(guān)標記物能與干細胞相關(guān)標記物Nestin進行雙標，此外RGCs還能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞以及少突膠質(zhì)細胞； （2）切割穹窿海馬傘側(cè)的海馬提取液能夠明顯促進RGCs的增殖和向神經(jīng)元分化；切割側(cè)海馬提取液聯(lián)合NGF能夠促進RGCs向ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元分化，這些ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元能夠表達Lhx8； （3） RGCs轉(zhuǎn)染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，分化為MAP2陽性神經(jīng)元的總體數(shù)目沒有明顯增加，但是能夠提高ChAT陽性細胞在MAP2陽性神經(jīng)元中所占的比例，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達量也明顯增高，說明轉(zhuǎn)染慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠促進RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化； （4）在正常海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，能夠明顯提高齒狀回內(nèi)ChAT/Lhx8陽性的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量；切割穹窿海馬傘并聯(lián)合慢病毒注射后，發(fā)現(xiàn)齒狀回內(nèi)ChAT/Lhx8陽性的膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量增加更為明顯，，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達量也明顯增高，說明切割穹窿海馬傘并且聯(lián)合應用Lenti6.3-Lhx8慢病毒可以明顯地促進海馬內(nèi)的膽堿能神經(jīng)再生水平。 四．結(jié)論： （1）體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs具有典型的雙突起形態(tài)學特征，這些細胞能夠同時表達膠質(zhì)細胞相關(guān)標記物和干細胞相關(guān)標記物。體外應用切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液能夠較好的模擬切割穹窿海馬傘后的海馬再生微環(huán)境。在RGCs擴增培養(yǎng)階段切割側(cè)海馬提取液能明顯地促進RGCs增殖，而在RGCs分化階段切割側(cè)海馬提取液也能夠促進RGCs更多地向神經(jīng)元分化； （2）慢病毒Lenti6.3-Lhx8能夠促進體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs向膽堿能神經(jīng)元分化，但對RGCs分化產(chǎn)生的神經(jīng)元總體數(shù)量沒有影響。Lhx8作為LIM同源盒基因家族成員，僅在神經(jīng)元膽堿能表型確立方面起到作用，而不能促進體外培養(yǎng)的海馬源性RGCs更多地向神經(jīng)元分化； （3）慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入海馬齒狀回后，齒狀回ChAT陽性膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量與正常海馬比較明顯增多。在切割穹窿海馬傘側(cè)的海馬齒狀回中注入慢病毒Lenti6.3-Lhx8后，發(fā)現(xiàn)ChAT陽性的神經(jīng)元數(shù)量增加更為明顯，說明LIM同源盒基因家族成員Lhx8在切割穹窿海馬傘后的海馬膽堿能神經(jīng)再生過程中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R321

【共引文獻】

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本文編號：2312744