【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV))感染是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。盡管預(yù)防性乙肝疫苗的廣泛接種,極大的降低了HBV感染的發(fā)病率,但仍存在部分疫苗無/低應(yīng)答人群及免疫逃逸現(xiàn)象,因而迫切需要研制新型有效的治療性疫苗,打破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)；并且由于HBV宿主范圍狹窄,只感染人和少數(shù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物,缺乏理想的小動(dòng)物模型,限制了人們對(duì)HBV生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制及新型疫苗與藥物的研發(fā)和評(píng)價(jià)等方面的研究。 基于HBV動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀及疫苗發(fā)展的需求,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,將1.3拷貝的HBV基因組插入到自滅活HIV-1慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體骨架,構(gòu)建重組的HBV轉(zhuǎn)基因載體,并利用高壓尾靜脈注射的方法注入到小鼠體內(nèi),建立HBV成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型；同時(shí)制備含S+PreS1融合抗原的新型HBV顆粒樣疫苗與重組病毒載體疫苗,優(yōu)化不同佐劑組合方案或顆粒樣疫苗與不同重組病毒載體疫苗聯(lián)合應(yīng)用,分析其在小鼠中誘導(dǎo)的抗原特異的免疫應(yīng)答,初步優(yōu)化HBV疫苗的免疫方案；進(jìn)一步利用已建立的HBV成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型,基于前期優(yōu)化的新型HBV疫苗的免疫方案,綜合分析HBV疫苗所誘導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答特點(diǎn),并評(píng)價(jià)疫苗免疫后在HBV感染小鼠體內(nèi)的免疫保護(hù)和免疫清除作用。 本研究取得的主要結(jié)果簡(jiǎn)述如下： 一、乙肝成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及條件優(yōu)化 1、HBV基因組轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)優(yōu)化利用慢病毒載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pCS-CG骨架,篩選出正向插入1.3拷貝HBV基因組的pCS-HBV1.3K轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒最適宜用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。 2、兩種HBV轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒(pCS-HBV1.3與pAAV-HBV1.3)用于建立HBV成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型的比較分別將篩選出的pCS-HBV1.3K(以下簡(jiǎn)稱pCS-HBV1.3)與前期構(gòu)建的pAAV-HBV1.3質(zhì)粒經(jīng)高壓水動(dòng)力法尾靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi),比較HBV標(biāo)志物的表達(dá),發(fā)現(xiàn)pCS-HBV1.3注射后,小鼠體內(nèi)上述HBV標(biāo)志物持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),抗體出現(xiàn)晚,且肝組織中HBV DNA水平高,因而確定轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒pCS-HBV1.3更適合于建立HBV持續(xù)感染動(dòng)物模型。 3、小鼠品系、性別、年齡及質(zhì)粒注射量對(duì)建立HBV成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型的影響分別選擇不同品系(C57BL/6和BALB/c)、不同劑量(5μg或10μg)、不同年齡(6周齡和18周齡)、不同性別的小鼠注射pCS-HBV1.3質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)6周齡雌性C57BL/6小鼠更適合建立HBV持續(xù)感染模型。 二、新型HBV顆粒樣疫苗與不同佐劑或不同載體疫苗聯(lián)合應(yīng)用在小鼠中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特征分析 1、HBV新型顆粒疫苗與重組病毒載體疫苗的制備與鑒定分別構(gòu)建制備了含HBVS+PreS1、C+PreS1融合抗原的重組痘苗病毒載體疫苗,含HBV S+PreS1融合抗原的重組腺病毒載體疫苗,證實(shí)目的蛋白的表達(dá)；用電鏡及免疫電鏡的方法證實(shí)CHO表達(dá)的含S+PreS1融合抗原疫苗HBSS1的表達(dá)及顆粒結(jié)構(gòu)。 2、含HBV S+PreS1融合抗原的新型顆粒疫苗與重組痘苗病毒載體疫苗聯(lián)合免疫在小鼠體內(nèi)的免疫效果評(píng)價(jià)比較含HBV S+PreS1融合抗原的蛋白顆粒疫苗和重組痘苗病毒的不同聯(lián)合免疫策略,發(fā)現(xiàn)HBV新型蛋白顆粒疫苗初免、重組痘苗病毒加強(qiáng)后可加速抗體陽轉(zhuǎn),產(chǎn)生高水平的S及PreS1的特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),同時(shí)伴有高水平的CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生,明顯優(yōu)于蛋白顆粒疫苗同源免疫方案及重組痘苗病毒初免、蛋白顆粒疫苗加強(qiáng)的聯(lián)合免疫方案。 3、HBV顆粒樣疫苗結(jié)合不同佐劑初免與重組腺病毒載體疫苗聯(lián)合免疫誘發(fā)的免疫應(yīng)答特點(diǎn)分析HBV疫苗應(yīng)用CpG和A1(OH)3佐劑可提高HBVS蛋白疫苗的抗體陽轉(zhuǎn)率和抗體滴度,并且重組腺病毒加強(qiáng)以后,抗原特異性的細(xì)胞免疫亦有所增強(qiáng)；而對(duì)于含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白顆粒疫苗,CpG和PolyI：C聯(lián)合鋁佐劑可產(chǎn)生高水平的S及PreS1的特異性抗體以及抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng),HBSS1聯(lián)合Poly I:C/Alum混合佐劑初免重組腺病毒加強(qiáng)后,同時(shí)伴有高水平的CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子IFN-y和IL-2產(chǎn)生；未觀測(cè)到CNB佐劑及其聯(lián)合Alum佐劑后對(duì)HBSS1抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用。 三、HBV成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用于HBV新型疫苗免疫保護(hù)與免疫清除效果評(píng)價(jià) 1、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保護(hù)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用在前述HBV疫苗免疫方案優(yōu)化的研究基礎(chǔ)上,首先選用含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白顆粒疫苗(HBSS1)與含S蛋白HBV顆粒疫苗(HBS)結(jié)合不同佐劑、或蛋白顆粒疫苗與重組痘苗病毒載體疫苗(RVJSS1),或蛋白顆粒疫苗與重組腺病毒載體疫苗(rAdSSl)聯(lián)合免疫小鼠,系統(tǒng)比較了其抗原特異性體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答特點(diǎn)；末次免疫后2周采用pCS-HBV1.3質(zhì)粒攻擊對(duì)照小鼠與各疫苗免疫小鼠建立HBV持續(xù)感染狀態(tài)。然后比較小鼠血清HBsAg、HBeAg、 HBV DNA及肝組織DNA表達(dá)水平變化。發(fā)現(xiàn)在上述疫苗免疫后誘導(dǎo)的抗S抗體均能清除血清HBsAg;而HBSS1聯(lián)合RVJSS1或rAdSSl可同時(shí)清除血清HBsAg和HBV DNA,并可顯著降低血清HBeAg的表達(dá)水平。進(jìn)一步采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)免疫保護(hù)除與其誘導(dǎo)的高滴度的S、PreS1特異性的抗體應(yīng)答相關(guān)外,還與其誘發(fā)的多種抗原特異性的細(xì)胞因子密切相關(guān)。 2、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在HBV新型疫苗免疫清除評(píng)價(jià)中的應(yīng)用選取6周齡的C57BL/6小鼠,在免疫前5天尾靜脈高壓注射5μgpCS-HBV1.3,建立HBV慢性感染的小鼠模型,之后接受不同方案HBV疫苗的組合免疫,如前所述,采用多種方法系統(tǒng)分析不同HBV疫苗免疫方案所誘導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答及HBV慢性感染的小鼠血與肝組織中HBV標(biāo)志物,并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析免疫應(yīng)答與HBV清除效果的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HBSS1聯(lián)合重組痘苗病毒或重組腺病毒載體疫苗,可清除血清HBsAg抗原血癥,顯著降低血清中HBeAg及HBV DNA水平；清除效果主要與其誘導(dǎo)的高滴度的S、PreS1特異性的抗體應(yīng)答和Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。 本研究結(jié)果為新型HBV疫苗的進(jìn)一步研發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62;R-332;R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 田淑芳,宗芳,陳紅,王文,張陵林,王秀平,楊芙蓉,阮力;哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒表面S+PreS1融合抗原的理化和生物學(xué)性狀[J];病毒學(xué)報(bào);2002年04期

2 郭燕菊;王文;孫世惠;曾道炳;趙光宇;于虹;郭彥;譚文杰;盧實(shí)春;周育森;;免疫抑制劑地塞米松可明顯延長(zhǎng)乙型肝炎病毒抗原在水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型中的表達(dá)[J];病毒學(xué)報(bào);2010年01期

3 董小巖;尉遲捷;王剛;田文洪;陸月;張風(fēng)衛(wèi);王文;王岳;譚文杰;吳小兵;;高嗜肝性8型重組腺相關(guān)病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)法制備乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型[J];病毒學(xué)報(bào);2010年06期

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本文編號(hào)：2310199