【摘要】：腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagie Escherichia coli, EHEC) O157:H7自1982年被確認為致病菌以來的20多年中,其引發(fā)的食物中毒在世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157:H7因其能導致人類嚴重消化道疾病及嚴重并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征(HUS)而日益受到各國衛(wèi)生預防機構的重視,它產(chǎn)生的II型志賀毒素(Shiga toxin type Ⅱ, Stx2)現(xiàn)已被認為是最為重要的致病因子。然而目前臨床上對EHEC0157:H7感染尚缺乏有效的防治方法,而抗生素可促使0157菌釋放志賀毒素,而使患者并發(fā)HUS的危險性增加。 本課題組已制備一株抗EHEC O157:H7Stx2的鼠源單抗S2C4,該單抗的重輕鏈同種型分別為IgGl和K,其靶標表位位于Stx2的A亞基。該單抗已被證實可中和包括Stx2和其多個變種(如Stx2c,Stx2vha等)的生物活性,具有較廣的中和譜。但鼠源性單抗對人體有免疫原性,既會產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)誘發(fā)過敏反應,又不能有效激活人體的生物效應功能,在人體內(nèi)的半衰期也較短,因此,鼠源性單抗的這些自身局限性極大地限制了其作為治療制劑在人體內(nèi)的應用。人鼠嵌合抗體雖然仍有30%左右的鼠源性成分,但90%的HAMA反應是針對抗體恒定區(qū)的,所以,嵌合抗體能有效降低人體內(nèi)的HAMA反應。因此,本文擬制備人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG,對其進行免疫學活性鑒定,觀察cS2C4-IgG在體內(nèi)外對Stx2的中和作用,為研發(fā)有效治療腸出血性大腸桿菌感染的抗體藥物提供技術貯備。 研究目的 1.對鼠源單抗S2C4進行基因工程改造,構建真核表達載體pAc-k-CH3-Vκ-VH,并利用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG。 2.對cS2C4-IgG進行免疫學活性鑒定,觀察cS2C4-IgG對毒素Stx2的細胞中和作用和小鼠體內(nèi)保護作用。 研究方法 1.從分泌抗腸出血性大腸桿菌II型志賀毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細胞株S2C4中克隆抗體可變區(qū)基因,構建人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG真核表達載體并轉染Sf9昆蟲細胞,收集培養(yǎng)上清,采用Protein A親和層析柱純化,獲得人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG。 2.通過SDS-PAGE、Wester、免疫熒光、ELISA等方法,鑒定人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG的免疫學特性。 3.人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG的體外中和試驗,檢測cS2C4-IgG和鼠源單抗S2C4中和毒素Stx2對vero細胞的中和作用,24h后觀察記錄細胞存活情況,直至96h后結束。 4.人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG的動物保護作用,檢測cS2C4-IgG和鼠源單抗S2C4中和毒素Stx2對小鼠的保護作用。每天觀察小鼠存活情況,直至第12天結束,計算保護率。 研究結果 1.擴增獲得的鼠源單克隆抗體S2C4VH大小為354bp,Vκ大小為330bp。成功構建人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG真核表達載體；獲得純度較高的人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG。 2.Wester、免疫熒光等方法均證明cS2C4-IgG能夠有效與毒素Stx2結合；Western Blot可觀察到cS2C4-IgG與毒素Stx2的A亞基及其裂解片段A1結合；ELISA結果表明純化后的cS2C4-IgG仍保持與特異性抗原毒素Stx2結合能力。 3.人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG和鼠源單抗S2C4都能中和5TCID50劑量的毒素Stx2,并且隨著抗體劑量的增加,抗體對毒素感染細胞的中和作用也增強。cS2C4-IgG與S2C4的100%中和作用滴度均為1250μg/L(即62.5ng/50μL), cS2C4-IgG的50%中和作用滴度(IC50)為39μg/L(即1.9ng/50μL);S2C4的50%中和作用滴度(IC50)為58.5μg/L(即2.925ng/50μL)。 4.腹腔注射3.8～30μg只的cS2C4-IgG對小鼠的保護率可達83%～100%,1.9μg,/只以下的劑量對小鼠無保護作用；腹腔注射3.8～30μg,/只的S2C4對小鼠的保護率可達91%-100%,1.0μg／只以下的劑量對小鼠無保護作用。 結論 1.本研究通過桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)成功獲得了人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG,該抗體能夠有效與毒素Stx2的A亞基結合,保留了親本鼠單抗S2C4與特異性抗原的結合能力。 2.人鼠嵌合抗體cS2C4-IgG對純化毒素Stx2感染的細胞具有較好的中和作用,對純化毒素Stx2感染的小鼠具有較好的保護作用,與親本鼠源單S2C4的作用一致。提示cS2C4-IgG具有潛在的臨床應用價值,為進一步研發(fā)有效治療腸出血性大腸桿菌感染的抗體藥物提供了技術貯備。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2306008