發(fā)布時間：2018-10-31 09:07

【摘要】：志賀氏菌屬(Shigella spp.)細菌是一類革蘭氏染色呈陰性的桿狀病原菌,又稱為痢疾桿菌,其主要傳播途徑為糞口途徑,通過食物和水進入消化道之后借助自身釋放的毒力因子而突破胃腸屏障,侵入腸上皮細胞后發(fā)生進一步的增殖和擴散,從而引起相關(guān)炎癥,機體則表現(xiàn)為發(fā)熱、脫水、便血、腹痛及腹瀉等,臨床上稱為細菌性痢疾,嚴重的情況下能導(dǎo)致菌血癥,兒童由于自身免疫力較低而成為了主要的易感人群。并且細菌性痢疾的感染量極低,一般情況下10-100個病原菌就足以引起典型的感染癥狀,而這也是導(dǎo)致痢疾是發(fā)展中國家最主要的傳染病的原因之一,據(jù)不完全統(tǒng)計,每年1.65億痢疾患者中1.63億分布于發(fā)展中國家,而在我國痢疾也有很高的發(fā)病率。另外,目前細菌性感染的主要治療手段是使用抗生素,這種方法盡管在開始的時候見效很快,但是隨著病原菌自身突變的發(fā)生,耐藥菌株不斷出現(xiàn),導(dǎo)致現(xiàn)在超過90%的志賀氏菌臨床分離菌株對多種抗生素都具有一定程度的耐受性。盡管疫苗可以作為治療痢疾的有效途徑,但是由于目前尚未完全揭示志賀氏菌的具體致病機理以及宿主自身的免疫應(yīng)答機制,因此這也就成為了疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用的瓶頸。鑒于以上志賀氏菌自身的危害性以及目前治療手段的有限性,志賀氏菌的基礎(chǔ)性研究對于我國的衛(wèi)生防疫工作就顯得尤為迫切和必要。 大腸桿菌作為一類非致病性的腸道菌,盡管與志賀氏菌在表現(xiàn)型和致病性方面有著非常大的差異,但現(xiàn)代分子生物學(xué)研究卻發(fā)現(xiàn)二者在基因組水平上有著高度的同源性和相似性,它們的區(qū)別主要在于毒力大質(zhì)粒(virulent plasmid),所以有觀點認為志賀氏菌是由大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒進化而來的。侵襲性質(zhì)粒的獲得是志賀氏菌毒力性狀的關(guān)鍵性因素。毒力大質(zhì)粒是志賀氏菌胞內(nèi)游離于基因組之外的一個220kb左右的環(huán)狀結(jié)構(gòu),攜帶了侵襲和致病所需的大部分基因。 目前已有研究證明,僅僅是毒力大質(zhì)粒并不能使大腸桿菌K-12獲得與志賀氏菌相同的致病性,這就說明了從大腸桿菌到志賀氏菌的進化過程,還包含了志賀氏菌的基因組與毒力大質(zhì)粒之間的協(xié)同進化,相互適應(yīng),彼此協(xié)調(diào)過程。比如致病適應(yīng)性突變(Pathoadaptive Mutation)即是志賀氏菌通過調(diào)整染色體上某些基因的功能,使獲得毒力大質(zhì)粒之后的突變株能夠改變有關(guān)的表型從而更好地適應(yīng)選擇壓力,或者使獲得的毒力大質(zhì)粒上的毒力基因能夠得到充分的表達。 在目前的研究中,鮮有關(guān)于志賀氏菌毒力大質(zhì)粒對染色體調(diào)控的報道,而這也正是本研究的出發(fā)點和切入點。近幾年來,隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展,已先后完成了福氏志賀氏菌2a 301和2a 2457T等具有代表性菌株的測序工作,而這也為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展奠定了基礎(chǔ)。本研究借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法從蛋白角度對志賀氏菌的基因組和毒力大質(zhì)粒之間的相互調(diào)控進行了一系列基礎(chǔ)性研究,這將為進一步揭示志賀氏菌的進化及致病機理提供一個新的思路和視角。 首先,本研究根據(jù)質(zhì)粒不相容原理利用pKD46inc溫敏型載體驅(qū)除了志賀氏菌毒力大質(zhì)粒,構(gòu)建了毒力大質(zhì)粒無痕缺失突變株301△pCP,M90T△pWR501。利用質(zhì)粒誘動轉(zhuǎn)移技術(shù),通過固相交配過程,在輔助質(zhì)粒pRK2013的協(xié)助下,將因整合了pXL275質(zhì)粒而帶有氯霉素抗性標(biāo)記的志賀氏菌福氏2a 2457T株、福氏2a 301株以及福氏5a M90T株的重組毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入非致病大腸桿菌MG1655中,構(gòu)建了三株大腸桿菌毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株MG1655/pXL275-virG:pSF、MG1655/pXL275-virG:pCP以及MG1655/pXL275-virG:pWR501。為了消除pXL275質(zhì)粒的導(dǎo)入對實驗造成的影響,利用同源重組將pXL275質(zhì)粒整合到MG1655基因組中構(gòu)建了陰性對照突變株MG1655/pXL275。 在此基礎(chǔ)上對MG1655野生株、陰性對照突變株以及三株毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株進行了生理生化特征的研究,結(jié)果表明:毒力大質(zhì)粒以及pXL275質(zhì)粒的導(dǎo)入對大腸桿菌MG1655的物質(zhì)代謝影響不大。 另外,本研究借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法這一重要手段對所構(gòu)建的陰性對照突變株、毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株、MG1655野生株,毒力大質(zhì)粒無痕缺失突變株及其對應(yīng)的志賀氏菌野生株的蛋白表達進行了比較分析。制取了以上菌株37℃培養(yǎng)至生長晚期的全菌蛋白樣品后,應(yīng)用雙向凝膠電泳建立了相對應(yīng)的雙向電泳圖譜,通過比對圖譜,找出了差異表達蛋白并進行了膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定,結(jié)果表明:通過比較陰性對照突變株和MG1655野生株的雙向電泳譜,發(fā)現(xiàn)pXL275質(zhì)粒對MG1655的蛋白表達沒有產(chǎn)生顯著的影響;通過比較毒力大質(zhì)粒無痕缺失突變株和對應(yīng)的志賀氏菌野生株的蛋白表達譜,發(fā)現(xiàn)毒力大質(zhì)粒的驅(qū)除導(dǎo)致了IpaA、IpgC、VirA以及Mxi-Spa類蛋白等毒力蛋白的缺失;通過比較毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株和MG1655野生株的蛋白表達譜,發(fā)現(xiàn)毒力大質(zhì)粒的導(dǎo)入除了引起有關(guān)毒力蛋白的表達之外,也顯著抑制了MG1655酸抗性相關(guān)的谷氨酸脫羧酶的表達,而酸抗性則是與腸道菌的生存密切相關(guān)的。 由于雙向電泳中蛋白樣品已經(jīng)發(fā)生了變性裂解,所以雙向電泳圖譜中展示的是蛋白單體的信息,而細胞內(nèi)大多數(shù)蛋白功能的發(fā)揮是通過與其它蛋白形成復(fù)合物來實現(xiàn)的,所以為了獲得蛋白質(zhì)相互作用的信息,本研究又對以上菌株進行了BN/SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明:pXL275質(zhì)粒對MG1655的復(fù)合物表達沒有顯著的影響;而毒力大質(zhì)粒的導(dǎo)入則明顯改變了MG1655中復(fù)合物種類,即對大腸桿菌中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了一定程度的影響。 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了毒力大質(zhì)粒相關(guān)的缺失突變株,導(dǎo)入突變株以及陰性對照突變株,并在此基礎(chǔ)上獲得了菌株之間蛋白單體及復(fù)合物的差異表達信息,這都為下一步深入揭示志賀氏菌的染色體和毒力大質(zhì)粒之間的相互調(diào)控提供了重要的線索和視角。另外,本研究在構(gòu)建毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株中所采用的質(zhì)粒誘動轉(zhuǎn)移設(shè)計也為有關(guān)重組菌株的構(gòu)建提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2301607