【摘要】：志賀氏菌屬(Shigella spp.)細(xì)菌是一類革蘭氏染色呈陰性的桿狀病原菌,又稱為痢疾桿菌,其主要傳播途徑為糞口途徑,通過(guò)食物和水進(jìn)入消化道之后借助自身釋放的毒力因子而突破胃腸屏障,侵入腸上皮細(xì)胞后發(fā)生進(jìn)一步的增殖和擴(kuò)散,從而引起相關(guān)炎癥,機(jī)體則表現(xiàn)為發(fā)熱、脫水、便血、腹痛及腹瀉等,臨床上稱為細(xì)菌性痢疾,嚴(yán)重的情況下能導(dǎo)致菌血癥,兒童由于自身免疫力較低而成為了主要的易感人群。并且細(xì)菌性痢疾的感染量極低,一般情況下10-100個(gè)病原菌就足以引起典型的感染癥狀,而這也是導(dǎo)致痢疾是發(fā)展中國(guó)家最主要的傳染病的原因之一,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),每年1.65億痢疾患者中1.63億分布于發(fā)展中國(guó)家,而在我國(guó)痢疾也有很高的發(fā)病率。另外,目前細(xì)菌性感染的主要治療手段是使用抗生素,這種方法盡管在開始的時(shí)候見(jiàn)效很快,但是隨著病原菌自身突變的發(fā)生,耐藥菌株不斷出現(xiàn),導(dǎo)致現(xiàn)在超過(guò)90%的志賀氏菌臨床分離菌株對(duì)多種抗生素都具有一定程度的耐受性。盡管疫苗可以作為治療痢疾的有效途徑,但是由于目前尚未完全揭示志賀氏菌的具體致病機(jī)理以及宿主自身的免疫應(yīng)答機(jī)制,因此這也就成為了疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用的瓶頸。鑒于以上志賀氏菌自身的危害性以及目前治療手段的有限性,志賀氏菌的基礎(chǔ)性研究對(duì)于我國(guó)的衛(wèi)生防疫工作就顯得尤為迫切和必要。 大腸桿菌作為一類非致病性的腸道菌,盡管與志賀氏菌在表現(xiàn)型和致病性方面有著非常大的差異,但現(xiàn)代分子生物學(xué)研究卻發(fā)現(xiàn)二者在基因組水平上有著高度的同源性和相似性,它們的區(qū)別主要在于毒力大質(zhì)粒(virulent plasmid),所以有觀點(diǎn)認(rèn)為志賀氏菌是由大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒進(jìn)化而來(lái)的。侵襲性質(zhì)粒的獲得是志賀氏菌毒力性狀的關(guān)鍵性因素。毒力大質(zhì)粒是志賀氏菌胞內(nèi)游離于基因組之外的一個(gè)220kb左右的環(huán)狀結(jié)構(gòu),攜帶了侵襲和致病所需的大部分基因。 目前已有研究證明,僅僅是毒力大質(zhì)粒并不能使大腸桿菌K-12獲得與志賀氏菌相同的致病性,這就說(shuō)明了從大腸桿菌到志賀氏菌的進(jìn)化過(guò)程,還包含了志賀氏菌的基因組與毒力大質(zhì)粒之間的協(xié)同進(jìn)化,相互適應(yīng),彼此協(xié)調(diào)過(guò)程。比如致病適應(yīng)性突變(Pathoadaptive Mutation)即是志賀氏菌通過(guò)調(diào)整染色體上某些基因的功能,使獲得毒力大質(zhì)粒之后的突變株能夠改變有關(guān)的表型從而更好地適應(yīng)選擇壓力,或者使獲得的毒力大質(zhì)粒上的毒力基因能夠得到充分的表達(dá)。 在目前的研究中,鮮有關(guān)于志賀氏菌毒力大質(zhì)粒對(duì)染色體調(diào)控的報(bào)道,而這也正是本研究的出發(fā)點(diǎn)和切入點(diǎn)。近幾年來(lái),隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展,已先后完成了福氏志賀氏菌2a 301和2a 2457T等具有代表性菌株的測(cè)序工作,而這也為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展奠定了基礎(chǔ)。本研究借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法從蛋白角度對(duì)志賀氏菌的基因組和毒力大質(zhì)粒之間的相互調(diào)控進(jìn)行了一系列基礎(chǔ)性研究,這將為進(jìn)一步揭示志賀氏菌的進(jìn)化及致病機(jī)理提供一個(gè)新的思路和視角。 首先,本研究根據(jù)質(zhì)粒不相容原理利用pKD46inc溫敏型載體驅(qū)除了志賀氏菌毒力大質(zhì)粒,構(gòu)建了毒力大質(zhì)粒無(wú)痕缺失突變株301△pCP,M90T△pWR501。利用質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移技術(shù),通過(guò)固相交配過(guò)程,在輔助質(zhì)粒pRK2013的協(xié)助下,將因整合了pXL275質(zhì)粒而帶有氯霉素抗性標(biāo)記的志賀氏菌福氏2a 2457T株、福氏2a 301株以及福氏5a M90T株的重組毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入非致病大腸桿菌MG1655中,構(gòu)建了三株大腸桿菌毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株MG1655/pXL275-virG:pSF、MG1655/pXL275-virG:pCP以及MG1655/pXL275-virG:pWR501。為了消除pXL275質(zhì)粒的導(dǎo)入對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的影響,利用同源重組將pXL275質(zhì)粒整合到MG1655基因組中構(gòu)建了陰性對(duì)照突變株MG1655/pXL275。 在此基礎(chǔ)上對(duì)MG1655野生株、陰性對(duì)照突變株以及三株毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株進(jìn)行了生理生化特征的研究,結(jié)果表明:毒力大質(zhì)粒以及pXL275質(zhì)粒的導(dǎo)入對(duì)大腸桿菌MG1655的物質(zhì)代謝影響不大。 另外,本研究借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法這一重要手段對(duì)所構(gòu)建的陰性對(duì)照突變株、毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株、MG1655野生株,毒力大質(zhì)粒無(wú)痕缺失突變株及其對(duì)應(yīng)的志賀氏菌野生株的蛋白表達(dá)進(jìn)行了比較分析。制取了以上菌株37℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)晚期的全菌蛋白樣品后,應(yīng)用雙向凝膠電泳建立了相對(duì)應(yīng)的雙向電泳圖譜,通過(guò)比對(duì)圖譜,找出了差異表達(dá)蛋白并進(jìn)行了膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定,結(jié)果表明:通過(guò)比較陰性對(duì)照突變株和MG1655野生株的雙向電泳譜,發(fā)現(xiàn)pXL275質(zhì)粒對(duì)MG1655的蛋白表達(dá)沒(méi)有產(chǎn)生顯著的影響;通過(guò)比較毒力大質(zhì)粒無(wú)痕缺失突變株和對(duì)應(yīng)的志賀氏菌野生株的蛋白表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)毒力大質(zhì)粒的驅(qū)除導(dǎo)致了IpaA、IpgC、VirA以及Mxi-Spa類蛋白等毒力蛋白的缺失;通過(guò)比較毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株和MG1655野生株的蛋白表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)毒力大質(zhì)粒的導(dǎo)入除了引起有關(guān)毒力蛋白的表達(dá)之外,也顯著抑制了MG1655酸抗性相關(guān)的谷氨酸脫羧酶的表達(dá),而酸抗性則是與腸道菌的生存密切相關(guān)的。 由于雙向電泳中蛋白樣品已經(jīng)發(fā)生了變性裂解,所以雙向電泳圖譜中展示的是蛋白單體的信息,而細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白功能的發(fā)揮是通過(guò)與其它蛋白形成復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的,所以為了獲得蛋白質(zhì)相互作用的信息,本研究又對(duì)以上菌株進(jìn)行了BN/SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明:pXL275質(zhì)粒對(duì)MG1655的復(fù)合物表達(dá)沒(méi)有顯著的影響;而毒力大質(zhì)粒的導(dǎo)入則明顯改變了MG1655中復(fù)合物種類,即對(duì)大腸桿菌中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了一定程度的影響。 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了毒力大質(zhì)粒相關(guān)的缺失突變株,導(dǎo)入突變株以及陰性對(duì)照突變株,并在此基礎(chǔ)上獲得了菌株之間蛋白單體及復(fù)合物的差異表達(dá)信息,這都為下一步深入揭示志賀氏菌的染色體和毒力大質(zhì)粒之間的相互調(diào)控提供了重要的線索和視角。另外,本研究在構(gòu)建毒力大質(zhì)粒導(dǎo)入突變株中所采用的質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)也為有關(guān)重組菌株的構(gòu)建提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 王興旺;胡勇;宋偉舟;趙春;蘭英;;蒼術(shù)對(duì)雞大腸桿菌耐藥質(zhì)粒消除作用的研究[J];重慶工學(xué)院學(xué)報(bào);2006年02期

2 陳群,王勝春;黃芩和黃連對(duì)大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年Z1期

3 韓偉;張鐵;鐘秀會(huì);;中藥對(duì)細(xì)菌R質(zhì)粒消除作用的研究概況[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2006年08期

4 顧天釗;;志賀菌侵襲上皮細(xì)胞的分子機(jī)制[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊(cè));1998年06期

5 許虹;杜海燕;牛藝儒;;中藥對(duì)細(xì)菌耐藥質(zhì)粒消除作用的研究概況與展望[J];農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備;2009年07期

6 李萇清,周岐新,凌保東;耐藥質(zhì)粒消除的研究概況與展望[J];川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

7 商娜;朱力;劉小青;劉先凱;馮爾玲;游松;王恒j;;弗氏志賀菌2a 2457T株蛋白復(fù)合體BN/SDS-PAGE電泳方法的建立[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年03期

8 謝玲,應(yīng)萬(wàn)濤,張開泰,項(xiàng)小瓊,錢小紅,王玉芝,吳德昌;雙向電泳和肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)鑒定支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白質(zhì)ANX1-human[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2000年05期

9 葛堂棟,馮爾玲,晏本菊,王恒wt,黃留玉;痢疾桿菌酸抗性系統(tǒng)相關(guān)基因缺失突變體的構(gòu)建[J];生物技術(shù)通訊;2005年05期

10 項(xiàng)裕財(cái);R質(zhì)粒的紫外線消除試驗(yàn)改進(jìn)和體會(huì)[J];皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年02期

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本文編號(hào)：2301607