【摘要】：研究背景 白癜風(fēng)是表皮黑素細(xì)胞(MC)毀損導(dǎo)致的獲得性色素脫失性皮膚病。雖然該病并不影響個(gè)體生存,但可嚴(yán)重?fù)p害容貌外觀,妨礙工作、學(xué)習(xí)、婚戀等社交活動(dòng),導(dǎo)致沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),甚至發(fā)展成為心身性疾病,威脅家庭和睦及和諧社會(huì)的構(gòu)建。但棘手的是,由于其病因復(fù)雜、確切機(jī)制尚不明了,目前沿用的治療方法效果尚不完全令人滿意。因此,進(jìn)一步闡明白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)有著至關(guān)重要的意義,其中從干細(xì)胞生物學(xué)的角度出發(fā),探索皮膚干細(xì)胞→MC分化和增殖的調(diào)控機(jī)制將會(huì)是個(gè)有益的嘗試。 研究對(duì)象 皮膚干細(xì)胞是真、表皮及附屬器中處于未分化的原始階段、能進(jìn)行自我更新、同時(shí)也可分化成特定組織類型的“種子細(xì)胞”。其中,神經(jīng)嵴干細(xì)胞(NCSC)是源自胚胎神經(jīng)板的多能干細(xì)胞,其遷移并定居在毛囊隆突、毛乳頭和真皮,形成了皮膚黑素細(xì)胞、感覺神經(jīng)元和施萬細(xì)胞、真皮間質(zhì)細(xì)胞等成分。因其強(qiáng)大的遷移分化和再生修復(fù)能力,NCSC是維持皮膚微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要力量,更是色素形成、毛發(fā)生長(zhǎng)、創(chuàng)傷愈合等生理/病理功能的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。因此說,對(duì)于皮膚病特別是色素疾病的基礎(chǔ)研究,NCSC是個(gè)提綱挈領(lǐng)的切入點(diǎn)；對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和開發(fā)新療法,這也極具運(yùn)用前景。 研究結(jié)果 一、毛囊NCSC的分離培養(yǎng)和鑒定 干細(xì)胞龕是成體干細(xì)胞在體內(nèi)集中存儲(chǔ)的部位,它是由特定的基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的特殊微環(huán)境,毛囊隆突是皮膚NCSC最主要的龕之一 本課題以小鼠觸須為研究模型,采用顯微外科方法分離隆突,探索并優(yōu)化NCSC的培養(yǎng)方法。這些隆突來源干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新／增殖能力,能在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮的克隆性生長(zhǎng),形成三維球體結(jié)構(gòu)Bulge sphere。免疫熒光染色和RT-PCR顯示,它們表達(dá)多種NCSC標(biāo)志物如p75、Sox10、Nestin等和胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如Sox2、Klf4、cMyc等,進(jìn)一步說明其是由未分化的幼稚細(xì)胞構(gòu)成。在相應(yīng)藥物誘導(dǎo)下,隆突細(xì)胞可以定向分化成脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元、施萬細(xì)胞、骨和軟骨等多種細(xì)胞類型,可見其很高的多向分化潛能。 結(jié)論：皮膚NCSC來源豐富不受限,位置表淺易取材,多向分化運(yùn)用廣,倫理道德爭(zhēng)議小,是比骨髓、臍血等更理想的干細(xì)胞來源。我們建立了從毛囊顯微分離、NCSC培養(yǎng)到干細(xì)胞表型鑒定、多向分化誘導(dǎo)的一整套技術(shù)方法,為皮膚病基礎(chǔ)研究和臨床自體移植提供一種全新的干細(xì)胞來源。 二、毛囊NCSC的黑素定向分化 白癜風(fēng)恢復(fù)期常見以毛囊為中心的點(diǎn)狀色素沉著,同時(shí)病理顯示有無色素的未成熟MC從毛囊向表皮遷出；而少毛/無毛部位,復(fù)色困難；進(jìn)一步地,而且移植正常毛囊至白斑部位可以治療白癜風(fēng)：這都提示毛囊在成體皮膚色素系統(tǒng)的修復(fù)中起著重要作用。 我們以毛囊NCSC為種子細(xì)胞,經(jīng)過2-3周的MC方向誘導(dǎo),分化細(xì)胞呈現(xiàn)類似正常MC的多極樹突或雙極樹突外觀,并表達(dá)MC特異標(biāo)志物MITF和TYR。更重要的是,分化細(xì)胞呈多巴反應(yīng)陽性,能將無色的L-DOPA轉(zhuǎn)化成棕色色素顆粒,這就從功能上證實(shí)其具有合成黑色素的初步能力。 效率低下一直是困擾MC體外分化的難題。為此,我們反復(fù)比較了各種誘導(dǎo)劑的效果,最后選定了一個(gè)含有ET-3、SCF、Wnt3a和TPA等多種成分的“雞尾酒”式的復(fù)合配方,使得分化效率大幅上調(diào),可達(dá)將近40%。 為研究NCSC→MC分化的調(diào)控機(jī)制,我們以Realtime PCR動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)若干重要分子在分化過程中的時(shí)相變化,發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞“命運(yùn)決定”過程中屬于“早期”事件、處于信號(hào)通路上游的MITF和TRP-2在誘導(dǎo)后很快激活表達(dá),且表達(dá)幅度也很高；而處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游的TYR和Pmel17則較晚表達(dá)。 結(jié)論：皮膚NCSC是表皮和毛發(fā)MC的來源,NCSC→MC的分化調(diào)控是色素疾病發(fā)病和臨床干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。我們從干細(xì)胞技術(shù)出發(fā),建立了從NCSC→MC的高效分化方法,并初步研究了調(diào)控分化進(jìn)程的分子機(jī)制。該內(nèi)容為探索色素性皮膚病的成因和尋找新靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為臨床MC自體移植提供一種便捷的細(xì)胞來源。 三、毛囊NCSC的衰老 衰老是隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)和生理功能的慢性損傷,每個(gè)個(gè)體均無法避免、逆轉(zhuǎn)、或者中止。盡管抗衰老研究由來已久,但從干細(xì)胞生物學(xué)的角度切入?yún)s是個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域。 我們以不同年齡小鼠來源的毛囊NCSC為模型,研究衰老對(duì)干細(xì)胞干性即自我更新和多向分化能力,以及遷移等重要功能的影響。結(jié)果顯示隨著年齡增長(zhǎng),毛囊NCSC增殖能力下降,形成神經(jīng)球的數(shù)目減少、體積縮小,倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)；分化潛能亦顯著衰退,成脂、成黑素分化出現(xiàn)障礙。老年NCSC還表現(xiàn)出較差的遷移能力,其驅(qū)動(dòng)遷移的關(guān)鍵基因SIug表達(dá)下調(diào),而與細(xì)胞粘附/錨定相關(guān)的基因N-CAM、N-Cadherin表達(dá)上調(diào)。在細(xì)胞衰老機(jī)制上,我們發(fā)現(xiàn)老年NCSC有較多的SA-β-gal+衰老細(xì)胞、較少的BrdU+增殖細(xì)胞、較多的G0/G1期靜止細(xì)胞和較低的端粒酶活性。 結(jié)論：皮膚衰老的本質(zhì)是皮膚干細(xì)胞及其干細(xì)胞龕的衰老。本課題著重研究了衰老對(duì)毛囊NCSC干性的影響,并對(duì)其機(jī)制做了初步探索,這為解釋皮膚衰老的病理機(jī)制和探索抗衰老的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為替代治療如何選擇供體年齡提供了臨床建議。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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4 陳欣s，

本文編號(hào)：2298742