【摘要】：目的重組原核表達(dá)人降鈣素原(PCT)蛋白,制備抗人PCT單克隆抗體,建立高效檢測PCT化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。方法根據(jù)NCBI提供的PCT基因序列,按照大腸埃希菌偏愛密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成,通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切將其構(gòu)建到pET32a載體上;將pET32a-PCT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3),用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),采用Western blot法分析重組蛋白表達(dá)情況;用鎳親和純化柱純化重組蛋白,以此為抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合,采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,有限稀釋法進(jìn)行克隆化后再用間接ELISA法篩選陽性單克隆細(xì)胞;將陽性單克隆細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi),制備腹水單抗,經(jīng)Protein A/G純化后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定,采用間接ELISA方法對抗體的特異性、靈敏度以及親和力進(jìn)行鑒定;用NaIO4氧化HRP法標(biāo)記單克隆抗體,通過棋盤法篩選配對單克隆抗體,以篩選的配對抗體為捕捉抗體,建立雙抗夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析的血清學(xué)檢測體系,檢測臨床150例血清標(biāo)本,其中PCT升高(0.05ng/ml)120例,PCT陰性(0.05ng/ml)30例。結(jié)果共篩選出6株抗人PCT蛋白的單克隆細(xì)胞,制備的腹水效價均大于4×10~(-6);通過棋盤法篩選得到2對能夠進(jìn)行雙抗夾心配對的單抗,其中1對親和力較高,其親和力常數(shù)分別為2.39×10~8 L/mol和2.91×10~8 L/mol。雙抗夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測線性范圍為0.06~8ng/ml,其中陽性檢出率為96.6%,陰性符合率為100%,與臨床檢測數(shù)據(jù)相比,相關(guān)系數(shù)R~2=0.9737。結(jié)論建立的雙抗夾心ELISA方法靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定可靠,可用于細(xì)菌、寄生蟲等病原體感染患者的PCT血清學(xué)定量檢測。
[Abstract]:Objective to express human procalcitonin (PCT) protein in prokaryotic expression and to prepare monoclonal antibody against human PCT and to establish an efficient chemiluminescence immunoassay for the detection of human calcitonin (PCT). Methods according to the sequence of PCT gene provided by NCBI, the whole gene was synthesized by optimizing the codon preference of Escherichia coli, and was constructed into pET32a vector by double digestion of BamH 鈪，

本文編號：2294075