【摘要】：哺乳動(dòng)物自胚胎形成時(shí),初級(jí)卵母細(xì)胞便停滯在雙線期(Diplotene stage),被一層前顆粒細(xì)胞密切圍繞形成靜止的始基卵泡(Primordial follicle);青春期后分批被激活和征募,進(jìn)入發(fā)育的軌道。隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育,染色質(zhì)逐漸濃集并向核仁周圍遷移,在生發(fā)泡破裂(GVBD)前完成核型結(jié)構(gòu)的改變。與核成熟相關(guān)的GVBD標(biāo)志著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)和開始。同時(shí),卵母細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄活性逐漸抑制,最終于排卵前期呈現(xiàn)整體水平的轉(zhuǎn)錄靜止。這種大規(guī)模轉(zhuǎn)錄沉默儲(chǔ)存了豐富的母源性物質(zhì)而成為排卵前卵母細(xì)胞獲得第一次減數(shù)分裂及其后繼發(fā)育潛能的前提條件。因此,染色質(zhì)的重塑(Chromatin Remolding)和大規(guī)模轉(zhuǎn)錄沉默的啟動(dòng),正是排卵前卵母細(xì)胞能夠恢復(fù)減數(shù)分裂從而獲得進(jìn)一步成熟的核心基礎(chǔ)。 在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中,通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從MII期母源蛋白譜系中鑒定出PCBP1蛋白。已經(jīng)證實(shí),在哺乳動(dòng)物中,PCBP1蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮多重而復(fù)雜的調(diào)節(jié)功能;同時(shí)有研究顯示,與MII期小鼠卵母細(xì)胞相比該蛋白在未成熟的生發(fā)泡(Germinal Vesicle,GV)期表達(dá)更為豐富,且本研究中熒光定位結(jié)果顯示,PCBP1蛋白于GV期卵母細(xì)胞胞核中特異性表達(dá)。上述結(jié)果使我們將注意力集中到PCBP1蛋白在GV期卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂成熟過程中的功能。 我們分別運(yùn)用兩對(duì)siRNAs分別特異性阻斷PCBP1蛋白在小鼠GV期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的功能。結(jié)果顯示,PCBP1蛋白的功能缺失顯著導(dǎo)致了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟進(jìn)程的顯著障礙;以及NSN/SN核型比例的失衡提示我們?nèi)旧|(zhì)重塑過程明顯受到干擾。進(jìn)一步應(yīng)用轉(zhuǎn)錄標(biāo)記物及表達(dá)譜芯片綜合分析了排卵前卵母細(xì)胞基因組整體水平的轉(zhuǎn)錄狀態(tài),結(jié)果顯示這些發(fā)育阻滯的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性呈現(xiàn)出異于常態(tài)的活躍。而通過對(duì)PCBP1與核纖層蛋白LaminA/C相互作用的深入探索,最終揭示了這種由PCBP1蛋白功能缺失所導(dǎo)致的卵母細(xì)胞成熟障礙,是通過LaminA/C為介導(dǎo),通過干擾其參與的核型重塑事件進(jìn)而影響排卵前卵細(xì)胞基因組整體轉(zhuǎn)錄水平,造成轉(zhuǎn)錄抑制無法啟動(dòng);與正常生理機(jī)制相悖的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄活躍,直接致使母源性效應(yīng)建立的失敗,從而最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的障礙。 綜上,本研究證實(shí)了PCBP1蛋白作為一個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞核內(nèi)特異表達(dá)的母源蛋白,通過參與卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的染色質(zhì)構(gòu)型重塑及宏觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控,從而推進(jìn)了GV期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟。這一研究為我們深刻理解小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),切入了伴隨成熟而啟動(dòng)的基因組整體轉(zhuǎn)錄沉默事件這一獨(dú)特視角。我們相信在哺乳動(dòng)物雌性配子的發(fā)育相關(guān)研究中,PCBP1蛋白將作為正性調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的關(guān)鍵因子之一,而被人們重新認(rèn)識(shí)。
[Abstract]:In mammalian self-embryogenesis primary oocytes stagnate in the two-line phase (Diplotene stage), is closely surrounded by a layer of pre-granulosa cells around the formation of static primordial follicle (Primordial follicle); after puberty by batch activation and recruitment into the development of the orbit. With the development of oocytes, chromatin gradually accumulated and migrated around the nucleoli, and the karyotype structure was changed before the blastocyst rupture of (GVBD). GVBD associated with nuclear maturation marks the recovery and commencement of meiosis in oocytes. At the same time, the genomic transcriptional activity of oocytes was inhibited gradually, and at the preovulation stage, the transcriptional activity remained at a global level. This massive transcriptional silencing is a prerequisite for the first meiosis and subsequent developmental potential of pre-ovulation oocytes. Therefore, the initiation of chromatin remodeling (Chromatin Remolding) and large-scale transcriptional silencing is the core basis for preovulation oocytes to resume meiosis and gain further maturation. The PCBP1 protein was identified from the maternal protein lineage of MII by proteomics. It has been demonstrated that PCBP1 protein plays multiple and complex regulatory functions at the transcriptional level in mammals, and studies have shown that the protein is more expressed in immature Germinal Vesicle,GV stage than in MII phase mouse oocytes. The results of fluorescence localization showed that PCBP1 protein was specifically expressed in the nucleus of GV oocytes. These results focus our attention on the function of PCBP1 protein during the first meiotic maturation of GV oocytes. We used two pairs of siRNAs to specifically block the function of PCBP1 protein during meiotic maturation of mouse GV oocytes. The results showed that the functional loss of PCBP1 protein resulted in a significant obstacle in the process of meiosis and maturation of oocytes, and the imbalance of NSN/SN karyotype indicated that the process of chromatin remodeling was obviously interfered. Transcriptional markers and expression microarray were used to analyze the transcriptional status of the whole genome of preovulation oocytes. The results showed that the transcriptional activity of these developmental arrested oocytes showed abnormal activity. Through the deep exploration of the interaction between PCBP1 and nuclear laminin LaminA/C, it was revealed that the oocyte maturation disorder caused by the absence of PCBP1 protein was mediated by LaminA/C. By interfering with the karyotype remodeling events in which they are involved, the overall transcriptional level of the pre-ovulation oocyte genome is affected, resulting in the transcription inhibition being unable to be initiated; the transcription of large-scale transcripts, which are contrary to normal physiological mechanisms, is active. The failure of the establishment of maternal effect directly leads to the obstacle of oocyte meiosis. In conclusion, this study confirmed that PCBP1 protein, as a mother protein specifically expressed in the nucleus of primary oocytes, participates in chromatin remodeling and macro-transcriptional regulation during oocyte development. Thus, the meiotic maturation of GV oocytes was promoted. This study provides us with a profound understanding of the recovery of meiosis in mouse oocytes and cuts into the unique perspective of the global transcriptional silencing events that are initiated with maturation. We believe that in the development of mammalian female gametes, PCBP1 protein will be one of the key factors in positive regulation of meiosis and maturation of oocytes.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：2293934