【摘要】：非受體酪氨酸激酶c-abl基因位于人的第9號(hào)染色體，是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在細(xì)胞內(nèi)的同源基因，編碼蛋白分子量約為140kDa。c-Abl定位于多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，能夠被多種應(yīng)激信號(hào)活化，通過其酪氨酸激酶活性參與調(diào)控細(xì)胞增殖、骨架重塑、細(xì)胞黏附、氧化和DNA損傷應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞遷移等生命活動(dòng)，發(fā)揮重要的生理功能[1]。研究表明，c-Abl與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2-5]。c-abl敲除小鼠多效性表型為圍產(chǎn)期死亡率高、病原體易感性增強(qiáng)、免疫系統(tǒng)缺陷，，如胸腺和脾變小，T、B淋巴細(xì)胞發(fā)育嚴(yán)重受損[2]。c-Abl還參與TCR和BCR依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，c-Abl缺陷會(huì)導(dǎo)致TCR信號(hào)誘導(dǎo)、增殖、細(xì)胞因子分泌功能減弱[5]；B淋巴細(xì)胞表面分子CD19是c-Abl的激酶底物[6]。然而，目前c-Abl調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育和抗感染免疫應(yīng)答的分子機(jī)制并不清楚。 本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，c-Abl缺陷細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比，免疫蛋白酶體誘導(dǎo)亞基Mecl-1、調(diào)節(jié)亞基PA28α轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。免疫蛋白酶體在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中具有非常重要的作用，主要由IFNγ誘導(dǎo)形成。IFNγ是唯一一種II型干擾素，主要由活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等特性。IFNγ的生物學(xué)活性依賴于細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的激活，目前JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為廣泛研究和認(rèn)可[7,8]。首先IFNγ與細(xì)胞表面的IFNγ受體(IFNGR1和IFNGR2)相結(jié)合，使得胞內(nèi)與IFNGR2相連JAK2激酶發(fā)生自磷酸化，激活的JAK2磷酸化JAK1激酶，接著JAK1磷酸化IFNGR1440位酪氨酸，使其產(chǎn)生STAT1蛋白的錨定位點(diǎn)，被募集的STAT1蛋白701位酪氨酸被磷酸化，目前認(rèn)為可能[9]是被JAK2介導(dǎo)，同時(shí)STAT1Ser727在IFNγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也會(huì)被磷酸化[10]，活化的STAT1蛋白形成同源二聚體，與受體解聚，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合含有g(shù)amma激活序列(GAS)的基因啟動(dòng)子[11]，啟動(dòng)IFNγ效應(yīng)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗病毒生物學(xué)活性。 本研究我們首先利用熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示c-Abl敲低細(xì)胞中免疫蛋白酶體誘導(dǎo)亞基Lmp2和調(diào)節(jié)亞基PA28α的IFNγ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平低于野生型細(xì)胞，并且抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體Tap1本底轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)下調(diào)。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Lmp2和Tap1基因共用一個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，而且兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄均受到IFNγ調(diào)控[12]，因此我們構(gòu)建Lmp2轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，突變其中已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，結(jié)果顯示，c-Abl是通過GAS序列調(diào)控Lmp2基因轉(zhuǎn)錄。GAS轉(zhuǎn)錄活性由IFNγ經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JAK-STAT1中的關(guān)鍵因子STAT1調(diào)控，因此，提示我們c-Abl可能通過調(diào)控STAT1蛋白影響IFNγ效應(yīng)基因表達(dá)。 利用免疫共沉淀方法證明細(xì)胞內(nèi)源性和過表達(dá)c-Abl與STAT1能夠形成免疫復(fù)合物，GST-pull down和Far Western結(jié)果表明c-Abl與STAT1是直接相互作用，而且c-Abl通過其SH2結(jié)構(gòu)域與STAT1C端結(jié)合，利用細(xì)胞原位檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)Duo-Link發(fā)現(xiàn)IFNγ能夠增強(qiáng)c-Abl與STAT1的相互作用，并且具有IFNγ劑量依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IFNγ誘導(dǎo)c-Abl缺陷細(xì)胞中STAT1已知關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)Tyr701和Ser727磷酸化水平顯著弱于野生型細(xì)胞，這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化修飾對(duì)于STAT1蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活活性至關(guān)重要；通過過表達(dá)和體外激酶分析證明c-Abl能夠特異性磷酸化STAT1，并且質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果表明c-Abl介導(dǎo)STAT1Tyr701磷酸化；利用JAK2缺陷型細(xì)胞和JAK1/2激酶抑制劑證明c-Abl磷酸化STAT1不依賴于JAK激酶，并且c-Abl能夠促進(jìn)STAT1蛋白表達(dá)水平，調(diào)控其同源二聚體的形成及進(jìn)入細(xì)胞核。 實(shí)驗(yàn)最初已經(jīng)證明了c-Abl調(diào)控IFNγ應(yīng)答基因Lmp2和Tap1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為了更進(jìn)一步說明c-Abl通過磷酸化STAT1影響IFNγ效應(yīng)基因表達(dá)，同樣應(yīng)用定量PCR發(fā)現(xiàn)c-Abl缺陷細(xì)胞中IFNγ應(yīng)答基因Ip10和Isg15轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；IFNγ誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫蛋白酶體和抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體TAP主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)MHC-I類抗原的加工和提呈。研究表明，與普通蛋白酶體相比，免疫蛋白酶體更適合加工降解產(chǎn)生與MHC-I類分子相結(jié)合的抗原表位，抗原肽通過TAP提呈至MHC-I類分子并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，激活CD8+T淋巴細(xì)胞，殺傷病原體感染的靶細(xì)胞，阻斷病原體增殖[13]。通過抗原提呈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)c-Abl激酶活性受到抑制時(shí)，小鼠樹突細(xì)胞JawsII的MHC-I類抗原提呈能力顯著降低。在細(xì)胞水平上，我們證明c-Abl能夠調(diào)控IFNγ誘導(dǎo)的抗病毒生物學(xué)活性以及病毒的增殖能力，對(duì)于野生型MEF細(xì)胞，隨著IFNγ作用濃度的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗VSV病毒能力也逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)c-Abl激酶活性受到抑制或被敲低后，IFNγ不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒活性；同時(shí)我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度來評(píng)價(jià)NDV-GFP在細(xì)胞中的增殖能力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)c-Abl激酶活性受到抑制時(shí)，NDV-GFP在細(xì)胞中的增殖能力顯著增強(qiáng)，而外源導(dǎo)入c-Abl表達(dá)質(zhì)粒后能在一定程度上抑制病毒增殖。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)c-Abl能夠特異性磷酸化STAT1，調(diào)控IFNγ效應(yīng)基因表達(dá)及其抗病毒生物學(xué)活性，首次發(fā)現(xiàn)除JAK之外的非受體酪氨酸激酶c-Abl通過STAT1調(diào)控IFNγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，初步揭示了c-Abl參與調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制，為IFNγ抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作出重要補(bǔ)充。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 凌麗君;c-Abl調(diào)節(jié)AIF亞細(xì)胞定位的機(jī)理研究[D];中南大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2291579