【摘要】：背景：心血管疾病是危害人類(lèi)健康的一種常見(jiàn)疾病。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作為血管壁中層的重要的細(xì)胞組成部分，其分化、增殖、遷移和自噬在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。一般認(rèn)為，低分化程度的VSMC是血管平滑肌參與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，這一過(guò)程同時(shí)伴隨著VSMC細(xì)胞增殖和遷移能力的增強(qiáng)。細(xì)胞自噬過(guò)程是一種細(xì)。胞內(nèi)細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)等的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解途徑，在真核細(xì)胞中高度保守。大量研究表明細(xì)胞自噬參與了心血管系統(tǒng)的發(fā)育和發(fā)病過(guò)程，具有非常重要的作用。Sonic hedgehog（Shh），一個(gè)重要發(fā)育相關(guān)的有絲分裂素和形態(tài)發(fā)生素，參與了多個(gè)器官、組織的發(fā)育過(guò)程，并能在病理?xiàng)l件刺激下從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，在多種細(xì)胞的分化、增殖和遷移過(guò)程中起著重要作用。在發(fā)育過(guò)程中，阻斷或者異常激活Shh信號(hào)通路均會(huì)導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的發(fā)育異常；在心�；颊咧�， Shh信號(hào)通路的激活顯著促進(jìn)了缺血部位血管新生的過(guò)程；病理情況下，Shh信號(hào)通路的阻斷，雖然降低了血脂中氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow-density lipoprotein，ox-LDL）的水平，卻導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積的增大，但是具體的機(jī)制還有待研究。 目的：本文通過(guò)探究Shh如何影響VSMC分化、增殖、遷移和自噬過(guò)程，深入探究相關(guān)分子機(jī)制，從而為發(fā)展Shh作為治療心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化的潛在功能分子提供了理論依據(jù)。 方法： 1應(yīng)用C57BL/6J小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎新生內(nèi)膜模型，并借助于藥物載體PluronicF-127凝膠分別給于不同的處理，包括Shh信號(hào)通路抑制劑環(huán)王巴明（cyclopamine）、自噬抑制劑3-Methyladenine (3-MA)和AKT通路抑制劑四（AKTI IV）。分離不同處理的結(jié)扎部位頸動(dòng)脈組織，HE染色鑒定新生內(nèi)膜增生情況；Western blotting方法檢測(cè)Shh和自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3-II（microtubule-associated protein1light chain3-II，LC3-II）、遷移相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)差異。 2應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激體外培養(yǎng)的VSMC，建立VSMC體外分化模型。以外源重組Shh、Shh信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG處理的VSMC和四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)（tetracycline-regulatedexpression， T-Rex）誘導(dǎo)表達(dá)小鼠Shh基因的人細(xì)胞系為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PolymeRase chain reaction，RT-qPCR）、Western blotting方法，檢測(cè)Shh信號(hào)通路激活對(duì)VSMC收縮表型標(biāo)志物平滑肌α-肌動(dòng)蛋白（smoothmuscle α-actin，SM α-actin）、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白SM22（smooth muscle22，SM22）、myocardin表達(dá)的影響；應(yīng)用WST-1和bromodeoxyuridine(BrdU)摻入、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)Shh信號(hào)通路激活對(duì)TGF-β1抑制的細(xì)胞增殖的影響。 3應(yīng)用Trans-well和劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound healing)檢測(cè)了Shh信號(hào)通路激活對(duì)VSMC遷移和浸潤(rùn)的影響，并通過(guò)Western blotting、實(shí)時(shí)定量PCR和明膠酶譜法等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá)變化和活性變化情況，進(jìn)一步通過(guò)絲裂元活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，，MAPK)信號(hào)通路抑制劑PD98059和蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB/AKT)信號(hào)通路抑制劑AKTI IV探討MAPK和AKT信號(hào)通路在這一現(xiàn)象中扮演的角色。 4應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting、免疫熒光、掃描電子顯微鏡、自噬相關(guān)基因7（autophagy-related gene7，ATG7） siRNA基因沉默技術(shù)等方法，檢測(cè)Shh信號(hào)通路激活或抑制對(duì)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達(dá)變化情況，進(jìn)一步通過(guò)哺乳動(dòng)物Rapamycin靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)通路抑制劑雷帕霉素（rapamycin）和AKTI IV探討mTOR和AKT信號(hào)通路這一現(xiàn)象中扮演的角色。 結(jié)果： 1C57BL/6J小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎新生內(nèi)膜模型結(jié)果顯示，相較于未結(jié)扎組織，小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎部位的Shh和LC3-II表達(dá)顯著上調(diào)，而3-MA、AKTI IV和cyclopamine均顯著抑制頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜的增生，同時(shí)cyclopamine抑制了新生內(nèi)膜中LC3-II、MMP-2和MMP-9的表達(dá)； 2Shh信號(hào)通路的激活顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的VSMC收縮表型標(biāo)志物SM-αactin、SM22和myocardin的表達(dá)，并且促進(jìn)VSMC合成表型標(biāo)志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)。Shh信號(hào)通路的激活顯著逆轉(zhuǎn)TGF-β1所抑制的VSMC的增殖； 3Shh信號(hào)通路激活顯著促進(jìn)VSMC遷移和浸潤(rùn)，促進(jìn)了VSMC中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性的提高，同時(shí)激活了p42/44和AKT的磷酸化，相反，Shh信號(hào)通路抑制劑cyclopamine、MAPK通路抑制劑PD98059和AKT通路抑制劑AKTI IV顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性。 4Shh信號(hào)通路的激活顯著促進(jìn)VSMC自噬。Shh信號(hào)通路激活促進(jìn)自噬小體的數(shù)目明顯增多，上調(diào)了自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達(dá)，同時(shí)激活了p70S6K和4E-BP1的磷酸化。自噬小體與溶酶體結(jié)合抑制劑bafilomycin A1和蛋白酶抑制劑E64D、pepstainA通過(guò)抑制LC3-II在溶酶體中的降解增加了LC3-II的表達(dá)，cyclopamine和ATG7siRNA降低了LC3-II的表達(dá)，mTOR通路抑制劑rapamycin抑制了Shh誘導(dǎo)的p70S6K和4E-BP1的磷酸化，卻協(xié)同促進(jìn)了shh誘導(dǎo)的LC3-II的增加。AKTI IV抑制了Shh誘導(dǎo)的AKT的磷酸化，同時(shí)抑制了Shh誘導(dǎo)的LC3-II的表達(dá)和自噬小體的數(shù)目的增多。另外，Shh所誘導(dǎo)的VSMC自噬有利于細(xì)胞存活，而3-MA、bafilomycinA1、cyclopamine、AKTI IV和ATG7siRNA均抑制了這一過(guò)程。 結(jié)論： 1Shh抑制了TGF-β1所誘導(dǎo)的VSMC分化，削弱了TGF-β1所誘導(dǎo)的VSMC增殖； 2Shh通過(guò)MAPK、AKT信號(hào)通路激活依賴的方式促進(jìn)了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性的增強(qiáng)，從而促進(jìn)了VSMC的遷移和浸潤(rùn)過(guò)程； 3Shh通過(guò)mTOR信號(hào)通路非依賴而AKT信號(hào)通路依賴的方式促進(jìn)了VSMC的自噬過(guò)程，促進(jìn)了自噬小體的形成和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達(dá)，這一自噬過(guò)程有利VSMC的存活。 以上結(jié)論為發(fā)展Shh作為治療心血管疾病的潛在功能分子提供了理論依據(jù)。 細(xì)胞因子信號(hào)抑制子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一個(gè)負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白家族，通過(guò)多種方式抑制JAK/STAT(janus kinase/signaltransduction and activators of transcription)信號(hào)途徑。SOCS3是SOCS家族的重要成員，是一個(gè)重要的細(xì)胞因子抑制子。我們通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了小鼠SOCS3蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，并結(jié)合序列同源性分析和Motif搜索方法對(duì)SOCS3蛋白進(jìn)行了功能區(qū)預(yù)測(cè)，最后根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果成功構(gòu)建了缺失預(yù)測(cè)的功能區(qū)的SOCS3基因克隆，進(jìn)一步觀察了轉(zhuǎn)染后其對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞（bonemarrow cells，BMC）分化的影響。結(jié)果表明缺失脯氨酸富集區(qū)的SOCS3失去了促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化成CD8+T細(xì)胞的生物學(xué)功能，一定程度上證明了SOCS3的脯氨酸富集區(qū)是SOCS3發(fā)揮正常功能的一個(gè)不可缺失的重要功能區(qū)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南開(kāi)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R3411

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本文編號(hào)：2278957