【摘要】：背景：心血管疾病是危害人類健康的一種常見疾病。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）作為血管壁中層的重要的細胞組成部分，其分化、增殖、遷移和自噬在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。一般認為，低分化程度的VSMC是血管平滑肌參與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的基礎，這一過程同時伴隨著VSMC細胞增殖和遷移能力的增強。細胞自噬過程是一種細。胞內(nèi)細胞器、細胞質(zhì)等的亞細胞結(jié)構(gòu)降解途徑，在真核細胞中高度保守。大量研究表明細胞自噬參與了心血管系統(tǒng)的發(fā)育和發(fā)病過程，具有非常重要的作用。Sonic hedgehog（Shh），一個重要發(fā)育相關的有絲分裂素和形態(tài)發(fā)生素，參與了多個器官、組織的發(fā)育過程，并能在病理條件刺激下從靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，在多種細胞的分化、增殖和遷移過程中起著重要作用。在發(fā)育過程中，阻斷或者異常激活Shh信號通路均會導致心血管系統(tǒng)的發(fā)育異常；在心�；颊咧�， Shh信號通路的激活顯著促進了缺血部位血管新生的過程；病理情況下，Shh信號通路的阻斷，雖然降低了血脂中氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow-density lipoprotein，ox-LDL）的水平，卻導致動脈粥樣硬化斑塊體積的增大，但是具體的機制還有待研究。 目的：本文通過探究Shh如何影響VSMC分化、增殖、遷移和自噬過程，深入探究相關分子機制，從而為發(fā)展Shh作為治療心血管疾病如動脈粥樣硬化的潛在功能分子提供了理論依據(jù)。 方法： 1應用C57BL/6J小鼠頸動脈結(jié)扎新生內(nèi)膜模型，并借助于藥物載體PluronicF-127凝膠分別給于不同的處理，包括Shh信號通路抑制劑環(huán)王巴明（cyclopamine）、自噬抑制劑3-Methyladenine (3-MA)和AKT通路抑制劑四（AKTI IV）。分離不同處理的結(jié)扎部位頸動脈組織，HE染色鑒定新生內(nèi)膜增生情況；Western blotting方法檢測Shh和自噬標志物微管相關蛋白輕鏈3-II（microtubule-associated protein1light chain3-II，LC3-II）、遷移相關分子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的表達差異。 2應用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激體外培養(yǎng)的VSMC，建立VSMC體外分化模型。以外源重組Shh、Shh信號通路激動劑SAG處理的VSMC和四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)（tetracycline-regulatedexpression， T-Rex）誘導表達小鼠Shh基因的人細胞系為研究對象，應用實時定量PCR（Real-time PolymeRase chain reaction，RT-qPCR）、Western blotting方法，檢測Shh信號通路激活對VSMC收縮表型標志物平滑肌α-肌動蛋白（smoothmuscle α-actin，SM α-actin）、肌動蛋白相關蛋白SM22（smooth muscle22，SM22）、myocardin表達的影響；應用WST-1和bromodeoxyuridine(BrdU)摻入、流式細胞術等方法檢測Shh信號通路激活對TGF-β1抑制的細胞增殖的影響。 3應用Trans-well和劃痕實驗(Wound healing)檢測了Shh信號通路激活對VSMC遷移和浸潤的影響，并通過Western blotting、實時定量PCR和明膠酶譜法等實驗方法，檢測MMP-2和MMP-9的表達變化和活性變化情況，進一步通過絲裂元活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，，MAPK)信號通路抑制劑PD98059和蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB/AKT)信號通路抑制劑AKTI IV探討MAPK和AKT信號通路在這一現(xiàn)象中扮演的角色。 4應用實時定量PCR、Western blotting、免疫熒光、掃描電子顯微鏡、自噬相關基因7（autophagy-related gene7，ATG7） siRNA基因沉默技術等方法，檢測Shh信號通路激活或抑制對自噬標志物LC3-II的表達變化情況，進一步通過哺乳動物Rapamycin靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)通路抑制劑雷帕霉素（rapamycin）和AKTI IV探討mTOR和AKT信號通路這一現(xiàn)象中扮演的角色。 結(jié)果： 1C57BL/6J小鼠頸總動脈結(jié)扎新生內(nèi)膜模型結(jié)果顯示，相較于未結(jié)扎組織，小鼠頸總動脈結(jié)扎部位的Shh和LC3-II表達顯著上調(diào)，而3-MA、AKTI IV和cyclopamine均顯著抑制頸總動脈新生內(nèi)膜的增生，同時cyclopamine抑制了新生內(nèi)膜中LC3-II、MMP-2和MMP-9的表達； 2Shh信號通路的激活顯著抑制TGF-β1誘導的VSMC收縮表型標志物SM-αactin、SM22和myocardin的表達，并且促進VSMC合成表型標志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達。Shh信號通路的激活顯著逆轉(zhuǎn)TGF-β1所抑制的VSMC的增殖； 3Shh信號通路激活顯著促進VSMC遷移和浸潤，促進了VSMC中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達和活性的提高，同時激活了p42/44和AKT的磷酸化，相反，Shh信號通路抑制劑cyclopamine、MAPK通路抑制劑PD98059和AKT通路抑制劑AKTI IV顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達和活性。 4Shh信號通路的激活顯著促進VSMC自噬。Shh信號通路激活促進自噬小體的數(shù)目明顯增多，上調(diào)了自噬標志物LC3-II的表達，同時激活了p70S6K和4E-BP1的磷酸化。自噬小體與溶酶體結(jié)合抑制劑bafilomycin A1和蛋白酶抑制劑E64D、pepstainA通過抑制LC3-II在溶酶體中的降解增加了LC3-II的表達，cyclopamine和ATG7siRNA降低了LC3-II的表達，mTOR通路抑制劑rapamycin抑制了Shh誘導的p70S6K和4E-BP1的磷酸化，卻協(xié)同促進了shh誘導的LC3-II的增加。AKTI IV抑制了Shh誘導的AKT的磷酸化，同時抑制了Shh誘導的LC3-II的表達和自噬小體的數(shù)目的增多。另外，Shh所誘導的VSMC自噬有利于細胞存活，而3-MA、bafilomycinA1、cyclopamine、AKTI IV和ATG7siRNA均抑制了這一過程。 結(jié)論： 1Shh抑制了TGF-β1所誘導的VSMC分化，削弱了TGF-β1所誘導的VSMC增殖； 2Shh通過MAPK、AKT信號通路激活依賴的方式促進了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達和活性的增強，從而促進了VSMC的遷移和浸潤過程； 3Shh通過mTOR信號通路非依賴而AKT信號通路依賴的方式促進了VSMC的自噬過程，促進了自噬小體的形成和自噬標志物LC3-II的表達，這一自噬過程有利VSMC的存活。 以上結(jié)論為發(fā)展Shh作為治療心血管疾病的潛在功能分子提供了理論依據(jù)。 細胞因子信號抑制子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一個負調(diào)控細胞因子信號轉(zhuǎn)導的蛋白家族，通過多種方式抑制JAK/STAT(janus kinase/signaltransduction and activators of transcription)信號途徑。SOCS3是SOCS家族的重要成員，是一個重要的細胞因子抑制子。我們通過生物信息學方法分析了小鼠SOCS3蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，并結(jié)合序列同源性分析和Motif搜索方法對SOCS3蛋白進行了功能區(qū)預測，最后根據(jù)預測結(jié)果成功構(gòu)建了缺失預測的功能區(qū)的SOCS3基因克隆，進一步觀察了轉(zhuǎn)染后其對小鼠骨髓細胞（bonemarrow cells，BMC）分化的影響。結(jié)果表明缺失脯氨酸富集區(qū)的SOCS3失去了促進骨髓細胞分化成CD8+T細胞的生物學功能，一定程度上證明了SOCS3的脯氨酸富集區(qū)是SOCS3發(fā)揮正常功能的一個不可缺失的重要功能區(qū)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R3411

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本文編號：2278957