【摘要】：日本血吸蟲病仍然是在我國南方流行的一種人獸共患病。長期血防實踐證明,要控制血吸蟲病的流行,有必要采用高效安全的抗血吸蟲病的分子疫苗。因此,怎樣合理高效地篩選和鑒定抗血吸蟲的保護(hù)性分子一直是個熱點和難點課題。選擇血吸蟲體表相關(guān)分子,評價它們是否能夠模擬輻照致弱RA尾蚴疫苗的保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制,可能是個值得探索的方向。本課題組陳雷等前期的初步研究發(fā)現(xiàn):預(yù)測的含有信號肽的日本血吸蟲鞘脂激活蛋白原(SjPSAP)分子可能存在于蟲體的體被膜上,來源于SjPSAP分子中的一個肽序列可能是個潛在的T細(xì)胞表位,推測它可能是個新的抗血吸蟲的保護(hù)性候選抗原分子。因此,本研究進(jìn)一步評價了SjPSAP分子的免疫生物學(xué)功能,旨在為高效合理發(fā)現(xiàn)抗血吸蟲的保護(hù)性抗原提供基礎(chǔ)。 首先,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和表達(dá)SjPSAP分子,分析了該分子的免疫原性,觀察了SjPSAP分子在不同期別蟲體中的組織定位。結(jié)果成功克隆和表達(dá)了分子量為106kDa的重組蛋白(rSjPSAP);Westen Bloting分析顯示,該重組蛋白可被其免疫小鼠血清和感染日本血吸蟲的小鼠陽性血清所識別,并且重組蛋白免疫鼠血清還可以識別7d、14d、23d、32d和42d的血吸蟲蟲體蛋白;免疫熒光檢測到在日本血吸蟲7d、14d、23d、32d和42d的蟲體體被的表膜均可見綠色熒光信號。說明rSjPSAP具有一定的抗原性,該分子可以定位于血吸蟲的體表膜部位。 為評價SjPSAP分子是否具有模擬血吸蟲RA疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生以Th1類CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性效應(yīng)功能,對該分子中可能存在的Th細(xì)胞表位進(jìn)行了篩選和鑒定。首先是應(yīng)用SYFPEITHI,MHCPred,HLAPRED以及ClusPro等在線服務(wù)器篩選出得到了可能與宿主MHCII類分子結(jié)合的11條肽;然后用人工合成的預(yù)測肽免疫小鼠,用改進(jìn)的MTT法體外檢測發(fā)現(xiàn)預(yù)測肽中有5條肽(p75-89,p402-416,p904-918,p93-107,p16-30)能夠明顯刺激免疫鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖(刺激指數(shù)SI值大于2,且它們的SI值與對照組的比較存在顯著差異,P0.05);ELISA法檢測結(jié)果有6條預(yù)測肽(p75-89,p809-823,p490-504,p904-918,p93-107,p16-30)以及陽性對照肽在刺激后,脾細(xì)胞分泌至上清中的IFN-γ量顯著增加;免疫鼠CD4+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌圖式測定顯示,p75-89,p402-416,p904-918,p93-107,p16-30肽體外刺激免疫鼠脾淋巴細(xì)胞后,分泌Th1細(xì)胞因子IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例要高于分泌Th2細(xì)胞因子IL-4的CD4+T細(xì)胞的比例;流式細(xì)胞術(shù)檢測體外直接結(jié)合鼠脾細(xì)胞實驗結(jié)果表明,62.62% 90.38%的細(xì)胞被生物素化的預(yù)測肽標(biāo)記上,用競爭性未標(biāo)記肽檢測顯示對標(biāo)記肽的結(jié)合抑制率在67.94%-90.78%之間,用抗I-Ad和抗I-Ed的抗體競爭孵育檢測,結(jié)果抑制率分別為57.61% 88.79%和35.55% 77.05%。說明SjPSAP分子中可能含有4個Th1細(xì)胞表位肽,這些肽表位都可以很好地與小鼠抗原遞呈細(xì)胞直接結(jié)合。 選用rSjPSAP和6個預(yù)測肽(包括上述已鑒定的4個潛在的Th1細(xì)胞表位肽和另外2個肽p809-823, p856-870),在BALB/c小鼠模型中進(jìn)行了抗血吸蟲的免疫保護(hù)實驗。結(jié)果顯示,rSjPSAP免疫誘導(dǎo)了40.57%和41.54%(P0.05)的減蟲率、40.39%和43.30%的肝組織減卵率;4個Th1表位肽免疫分別誘導(dǎo)了26.37%～28.75%和26.25%～28.69%的減蟲率、22.85%～29.61%和25.96%～30.90%的肝組織減卵率;另外2個肽(p809-823, p856-870)免疫則分別誘導(dǎo)了16.87%～18.57%和20%～20.81%的減蟲率、15.59%～20.17%和16.27%～20.72%的肝組織減卵率。rSjPSAP免疫后小鼠血清特異性抗體亞型IgG2a/IgG1的比值呈上升趨勢;4個Th1表位肽免疫小鼠血清IgG2a/IgG1的比值則呈現(xiàn)不同的變化趨勢;而另外2個肽免疫小鼠血清IgG1/IgG2a的比值變化趨勢不大。說明rSjPSAP及其所含的4個Th1細(xì)胞表位肽都具有一定的抗血吸蟲的保護(hù)性效果,且rSjPSAP的效果可能與其誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)。 總之,本研究鑒定了SjPSAP蛋白分布于蟲體的體被膜中,可能含4個潛在的Th1細(xì)胞表位,rSjPSAP及其表位肽免疫小鼠具有一定的抗血吸蟲的效果;為進(jìn)一步高效合理地發(fā)現(xiàn)抗血吸蟲的保護(hù)性T細(xì)胞抗原或表位提供了一定的理論和實驗依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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