發(fā)布時間：2018-10-17 12:13

【摘要】：背景與目的 Ag85B蛋白是結(jié)核分枝桿菌(M. tb)對數(shù)生長期分泌的保護性抗原,過表達Ag85B的重組卡介苗(rBCG)可以誘導(dǎo)比卡介苗(BCG)更強的抗M. tb保護效應(yīng),并已在國外完成I期臨床試驗。HspX蛋白是M. tb在體外穩(wěn)定期或體內(nèi)休眠狀態(tài)表達的優(yōu)勢蛋白;在氧耗盡或感染巨噬細胞后,BCG只表達微量的HspX。HspX蛋白能誘導(dǎo)M. tb感染者機體產(chǎn)生強烈的Th1型免疫應(yīng)答。BCG免疫后,可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對M. tb對數(shù)生長期分泌的保護性抗原的Th1應(yīng)答,但不會引起針對HspX特異性的IFN-γ免疫反應(yīng)。尚不清楚HspX蛋白能否用于研制rBCG。我們鑒定了過表達HspX蛋白的rBCG菌株(rBCG::X)、過表達Ag85B蛋白的rBCG菌株(rBCG::85B)和含有空載體pMV261的rBCG菌株(rBCG::261)等三個重組疫苗,將這些疫苗免疫小鼠,評價了它們的免疫原性和免疫保護性。 方法 1.在NCBI網(wǎng)站用BLASTn分析方法對M. tb的hspX基因序列進行生物信息學分析; 2. IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Ag85B和HspX的原核表達,并進行純化和鑒定,純化蛋白用于疫苗的免疫原性分析; 3.對rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261進行傳代培養(yǎng),利用Western blotting鑒定這三個重組菌株的培養(yǎng)上清和菌體裂解液,分析Ag85B和HspX蛋白表達情況和穩(wěn)定性; 4.將rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫C57BL/6小鼠,免疫后6周和24周,分別用ELISA檢測小鼠抗原特異性IgG抗體和用ELISPOT檢測脾淋巴細胞分泌抗原特異性IFN-γ水平; 5.將rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,小鼠免疫6周后,進行M. tb H37Rv毒株攻擊感染,感染4周后,分別檢測小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改變,比較評價重組疫苗對不同種屬小鼠的保護性。攻擊感染18周后,分別檢測C57BL/6小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改變,比較評價重組疫苗對C57BL/6小鼠的短期和長期保護性。 結(jié)果 1. hspX基因生物信息學分析顯示,與M. tb H37Rv菌株的hspX基因核苷酸序列一致性達100%的有7株細菌,均屬于M. tb復(fù)合體和BCG,包括一株MDR-TB菌株; 2.重組蛋白HspX和Ag85B原核表達純化過程的SDS-PAGE和純化蛋白的Western blotting,證實純化蛋白具有較高的純度和蛋白活性; 3.重組疫苗的培養(yǎng)上清和菌體裂解液的Western blotting顯示,rBCG::X在菌體裂解液中表達較高水平的HspX,培養(yǎng)上清中則有較高水平的Ag85B,且表達是穩(wěn)定的; 4. rBCG免疫C57BL/6小鼠后,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的體液和細胞免疫應(yīng)答。血清IgG抗體ELISA檢測顯示,與rBCG::261免疫小鼠比較,rBCG::X免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的HspX和Ag85B抗原特異性IgG抗體(p 0.05)。IFN-γELISPOT檢測顯示,rBCG::X實驗組在免疫后6周和24周,HspX和Ag85B蛋白特異性的分泌IFN-γ的細胞數(shù)比rBCG::261實驗組高(p 0.05); 5.在攻擊感染后4周和18周的荷菌量分析顯示,與rBCG::261免疫小鼠相比,rBCG::X免疫小鼠在抵抗M. tb感染時產(chǎn)生更加持久的保護效應(yīng),肺臟的荷菌量更少(p 0.05),病理變化更輕微。比較rBCG::X和rBCG::85B疫苗的保護效應(yīng),rBCG::X免疫小鼠肺臟的荷菌量有輕度顯著下降(p 0.05)。 結(jié)論 1. rBCG::X引起更高更持久的保護性可能與以下原因有關(guān):過表達HspX蛋白可能使rBCG::X形成更厚的細胞壁,在體內(nèi)持留時間延長;過表達的HspX和Ag85B,使這兩個抗原特異性IFN-γ顯著增加,從而使rBCG::X保護性顯著增強; 2.我們的結(jié)果證實,HspX蛋白作為BCG免疫人群和潛伏感染(LTBI)人群誘導(dǎo)差異免疫反應(yīng)的抗原,發(fā)展rBCG可以提高BCG的保護性。表明在抗結(jié)核病(TB)的疫苗研究中,這些差異免疫反應(yīng)抗原如M. tb潛伏感染抗原具有良好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2276620