發(fā)布時(shí)間：2018-10-17 12:13

【摘要】：背景與目的 Ag85B蛋白是結(jié)核分枝桿菌(M. tb)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌的保護(hù)性抗原,過(guò)表達(dá)Ag85B的重組卡介苗(rBCG)可以誘導(dǎo)比卡介苗(BCG)更強(qiáng)的抗M. tb保護(hù)效應(yīng),并已在國(guó)外完成I期臨床試驗(yàn)。HspX蛋白是M. tb在體外穩(wěn)定期或體內(nèi)休眠狀態(tài)表達(dá)的優(yōu)勢(shì)蛋白;在氧耗盡或感染巨噬細(xì)胞后,BCG只表達(dá)微量的HspX。HspX蛋白能誘導(dǎo)M. tb感染者機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答。BCG免疫后,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)M. tb對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌的保護(hù)性抗原的Th1應(yīng)答,但不會(huì)引起針對(duì)HspX特異性的IFN-γ免疫反應(yīng)。尚不清楚HspX蛋白能否用于研制rBCG。我們鑒定了過(guò)表達(dá)HspX蛋白的rBCG菌株(rBCG::X)、過(guò)表達(dá)Ag85B蛋白的rBCG菌株(rBCG::85B)和含有空載體pMV261的rBCG菌株(rBCG::261)等三個(gè)重組疫苗,將這些疫苗免疫小鼠,評(píng)價(jià)了它們的免疫原性和免疫保護(hù)性。 方法 1.在NCBI網(wǎng)站用BLASTn分析方法對(duì)M. tb的hspX基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析; 2. IPTG誘導(dǎo)重組蛋白Ag85B和HspX的原核表達(dá),并進(jìn)行純化和鑒定,純化蛋白用于疫苗的免疫原性分析; 3.對(duì)rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261進(jìn)行傳代培養(yǎng),利用Western blotting鑒定這三個(gè)重組菌株的培養(yǎng)上清和菌體裂解液,分析Ag85B和HspX蛋白表達(dá)情況和穩(wěn)定性; 4.將rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫C57BL/6小鼠,免疫后6周和24周,分別用ELISA檢測(cè)小鼠抗原特異性IgG抗體和用ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞分泌抗原特異性IFN-γ水平; 5.將rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,小鼠免疫6周后,進(jìn)行M. tb H37Rv毒株攻擊感染,感染4周后,分別檢測(cè)小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改變,比較評(píng)價(jià)重組疫苗對(duì)不同種屬小鼠的保護(hù)性。攻擊感染18周后,分別檢測(cè)C57BL/6小鼠脾臟和肺臟的荷菌量以及肺臟病理改變,比較評(píng)價(jià)重組疫苗對(duì)C57BL/6小鼠的短期和長(zhǎng)期保護(hù)性。 結(jié)果 1. hspX基因生物信息學(xué)分析顯示,與M. tb H37Rv菌株的hspX基因核苷酸序列一致性達(dá)100%的有7株細(xì)菌,均屬于M. tb復(fù)合體和BCG,包括一株MDR-TB菌株; 2.重組蛋白HspX和Ag85B原核表達(dá)純化過(guò)程的SDS-PAGE和純化蛋白的Western blotting,證實(shí)純化蛋白具有較高的純度和蛋白活性; 3.重組疫苗的培養(yǎng)上清和菌體裂解液的Western blotting顯示,rBCG::X在菌體裂解液中表達(dá)較高水平的HspX,培養(yǎng)上清中則有較高水平的Ag85B,且表達(dá)是穩(wěn)定的; 4. rBCG免疫C57BL/6小鼠后,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。血清IgG抗體ELISA檢測(cè)顯示,與rBCG::261免疫小鼠比較,rBCG::X免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的HspX和Ag85B抗原特異性IgG抗體(p 0.05)。IFN-γELISPOT檢測(cè)顯示,rBCG::X實(shí)驗(yàn)組在免疫后6周和24周,HspX和Ag85B蛋白特異性的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)比rBCG::261實(shí)驗(yàn)組高(p 0.05); 5.在攻擊感染后4周和18周的荷菌量分析顯示,與rBCG::261免疫小鼠相比,rBCG::X免疫小鼠在抵抗M. tb感染時(shí)產(chǎn)生更加持久的保護(hù)效應(yīng),肺臟的荷菌量更少(p 0.05),病理變化更輕微。比較rBCG::X和rBCG::85B疫苗的保護(hù)效應(yīng),rBCG::X免疫小鼠肺臟的荷菌量有輕度顯著下降(p 0.05)。 結(jié)論 1. rBCG::X引起更高更持久的保護(hù)性可能與以下原因有關(guān):過(guò)表達(dá)HspX蛋白可能使rBCG::X形成更厚的細(xì)胞壁,在體內(nèi)持留時(shí)間延長(zhǎng);過(guò)表達(dá)的HspX和Ag85B,使這兩個(gè)抗原特異性IFN-γ顯著增加,從而使rBCG::X保護(hù)性顯著增強(qiáng); 2.我們的結(jié)果證實(shí),HspX蛋白作為BCG免疫人群和潛伏感染(LTBI)人群誘導(dǎo)差異免疫反應(yīng)的抗原,發(fā)展rBCG可以提高BCG的保護(hù)性。表明在抗結(jié)核病(TB)的疫苗研究中,這些差異免疫反應(yīng)抗原如M. tb潛伏感染抗原具有良好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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8 岳晨莉;藤黃微球菌Rpf結(jié)構(gòu)域及其突變體基因的克隆、表達(dá)及生物活性的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2276620