【摘要】：腸道病毒7l型(EV71)是導(dǎo)致手足口病的主要病原體之一,常引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴重疾病。vp1是EV71病毒主要的抗原基因,其編碼的外衣殼蛋白在感染宿主細胞時起重要作用。因此,我們選擇vp1作為研制EV71疫苗的目標基因。LTB有很強的免疫原性和佐劑活性且無毒。本研究中選用LTB作為分子內(nèi)粘膜免疫佐劑。 雙歧桿菌正常存在于人類腸道內(nèi),是一種重要的有益的生菌,對人體腸道微環(huán)境有重要的調(diào)節(jié)功能,對嬰幼兒腸道有獨特的保護作用。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細胞。因此,本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個表達EV71 VP1蛋白和ETEC LTB蛋白的雙價口服活疫苗的抗原表達系統(tǒng)。 目的 構(gòu)建攜帶EV71病毒vp1基因和ltb基因的融合表達載體并在大腸桿菌和雙歧桿菌中進行表達,鑒定其抗原性和免疫原性。為制備預(yù)防EV71感染的口服疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法 用重疊延伸PCR(overlap extension PCR)法獲得人腸道病毒71型vp1片段與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(ltb)的融合基因。設(shè)計14對引物通過重疊延伸PCR技術(shù)合成vp1基因,以ETEC(44815)質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴增ltb基因,將vp1基因與ltb基因連接并測序,連接產(chǎn)物插入原核表達質(zhì)粒pBEX,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB,轉(zhuǎn)化E.coli B1221(DE3)進行表達,SDS-PAGE及Western blotting分析其表達。將表達VP1-LTB的大腸桿菌超聲破碎后離心提取包涵體制備抗原,經(jīng)口灌喂免疫小鼠,檢測小鼠血清中抗VP1的IgG、IgA,糞便sIgA和腸粘液sIgA,鑒定其免疫原性。電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB轉(zhuǎn)入雙歧桿菌,Western-blot分析其抗原性�？诜庖逽D大鼠,采集血清和糞便樣品,ELISA檢測機體特異的血清IgG和腸道IgA抗體。 結(jié)果 合成的vp1基因全長891bp,測序結(jié)果與預(yù)期相符,重組表達質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB經(jīng)PCR及雙酶切鑒定,表明構(gòu)建正確;目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中獲得了表達,Western-blot分析結(jié)果表明該蛋白具有與EV71 VP1抗體結(jié)合的抗原性,免疫后小鼠血清抗VP1的IgG、IgA以及糞便sIgA和腸粘液sIgA明顯高于PBS和GST對照組。電轉(zhuǎn)法成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雙歧桿菌, Western-blot分析結(jié)果表明該蛋白具有與EV71病毒抗體結(jié)合的抗原性。ELISA檢測表明重組雙歧桿菌免疫后的SD大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特性的IgG和IgA抗體。 結(jié)論 應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)成功構(gòu)建了EV71 VP1-LTB融合表達質(zhì)粒,并在E.coli BL21(DE3)和雙歧桿菌中獲得有生物學(xué)功能的VP1表達產(chǎn)物,該蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,為研制EV71分子內(nèi)佐劑疫苗打下了基礎(chǔ)。該研究表明重組載體pBEX-VP1-LTB可以在雙歧桿菌中表達。該重組VP1-LTB基因工程雙歧桿菌可誘發(fā)SD大鼠特異的粘膜免疫反應(yīng),為進一步研制基于雙歧桿菌表達系統(tǒng)的手足口病EV71重組亞單位口服活疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Enterovirus 7l (EV71) is one of the major pathogens leading to HFMD, which often causes many serious diseases related to the nervous system. Vp1 is the main antigen gene of EV71 virus, and its coat shell protein plays an important role in the infection of host cells. Therefore, we selected vp1 as the target gene for the development of EV71 vaccine. LTB has strong immunogenicity, adjuvant activity and non-toxicity. In this study, LTB was selected as intramolecular mucosal immune adjuvant. Bifidobacterium is an important and beneficial bifidobacterium that exists in human intestinal tract and has important regulation function to human intestinal microenvironment and unique protective effect to infant intestinal tract. Bifidobacterium is the natural host of the human gut and adheres to intestinal epithelial cells. Therefore, the aim of this study was to develop a bivalent oral live vaccine expressing EV71 VP1 protein and ETEC LTB protein into an antigen expression system of Bifidobacterium. Objective to construct a fusion expression vector carrying vp1 gene and ltb gene of EV71 virus and express them in Escherichia coli and Bifidobacterium to identify their antigenicity and immunogenicity. It lays the foundation for the preparation of oral vaccine to prevent EV71 infection. Methods the fusion gene of human enterovirus 71 vp1 fragment and Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (ltb) was obtained by overlapping extension PCR (overlap extension PCR) method. A total of 14 pairs of primers were designed to synthesize vp1 gene by overlapping extension PCR technique. The ltb gene was amplified by PCR using ETEC (44815) plasmid DNA as template. Vp1 gene was linked to ltb gene and sequenced. The recombinant plasmid pBEX-VP1-LTB, was transformed into E.coli B1221 (DE3) and expressed by SDS-PAGE and Western blotting. The inclusion bodies of E. coli expressing VP1-LTB were extracted by centrifugation after ultrasonic crushing. The mice were immunized by oral administration. The immunogenicity of IgG,IgA, stool sIgA and intestinal mucus sIgA, against VP1 in the serum of mice was detected. The recombinant plasmid pBEX-VP1-LTB was transformed into Bifidobacterium by electroporation and its antigenicity was analyzed by Western-blot. SD rats were immunized orally. Serum and fecal samples were collected. Serum IgG and intestinal IgA antibody were detected by ELISA. Results the total length of vp1 gene was 891bp.The result of sequencing was consistent with the expectation. The recombinant expression plasmid pBEX-VP1-LTB was identified by PCR and double enzyme digestion, which showed that the construction was correct. Objective the protein was expressed in E.coli BL21 (DE3). The results of Western-blot analysis showed that the protein was antigenicity to EV71 VP1 antibody. The serum anti-VP1 IgG,IgA, stool sIgA and intestinal mucus sIgA were significantly higher in immunized mice than those in PBS and GST control groups. The recombinant plasmid was successfully transferred into Bifidobacterium by electroporation. Western-blot analysis showed that the protein had the antigenicity of binding to EV71 virus antibody. ELISA detection showed that the SD rats immunized with recombinant bifidobacterium produced characteristic IgG and IgA antibodies. Conclusion the fusion expression plasmid of EV71 VP1-LTB was successfully constructed by using overlapping extension PCR technique, and the bifidobacterium (E.coli BL21) and bifidobacterium were used to obtain the bifidobacterium VP1 expression product. The protein has good antigenicity and immunogenicity. It lays a foundation for the development of EV71 intramolecular adjuvant vaccine. This study showed that the recombinant vector pBEX-VP1-LTB could be expressed in Bifidobacterium. The recombinant VP1-LTB gene engineering bifidobacterium can induce specific mucosal immune response in SD rats, which lays a foundation for the further development of oral live vaccine for EV71 recombinant subunit of HFMD based on Bifidobacterium expression system.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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5 廣州市微生物研究所 姚朔影 夏楓耿;展望雙歧桿菌的開發(fā)前景[N];中國食品質(zhì)量報;2004年

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7 ;基因抗癌需要“運載火箭”雙歧桿菌“上崗”堪當(dāng)重任[N];健康報;2001年

8 本報記者　 賴強;兩支疫苗的故事[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

9 王t，

本文編號：2265621