【摘要】：隨著艾滋病、糖尿病等疾病的發(fā)病率不斷上升，器官移植及導管技術(shù)的推廣普及，臨床上免疫受損患者日益增多，念珠菌系統(tǒng)感染發(fā)病率大幅上升。臨床使用抗真菌藥物的頻率和劑量有明顯增加導致真菌耐藥情況變得越來越嚴重，尤其對唑類藥物的耐受，給有效控制日益增高的念珠菌系統(tǒng)感染帶來嚴重困難，也使白念珠菌耐藥發(fā)生影響因素研究具有重大意義。 耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)，白念珠菌對葡萄糖含量極之敏感，培養(yǎng)基中0.001％的葡萄糖濃度改變，都會引起菌株調(diào)節(jié)代謝的核心基因發(fā)生改變，對唑類藥物的耐藥性增加。而白念珠菌在巨噬細胞內(nèi)以乙醛酸循環(huán)功能是該菌引起感染的關(guān)鍵。宿主巨噬細胞是一個葡萄糖，氨基酸等營養(yǎng)缺乏的微環(huán)境，微生物無法利用三羧酸循環(huán)進行物質(zhì)和能量代謝。巨噬細胞內(nèi)白念珠菌調(diào)節(jié)氧化、乙醛酸循環(huán)、糖異生等代謝途徑的各個關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，而糖酵解的關(guān)鍵酶則呈下調(diào)趨勢。因此我們推測，白念珠菌糖酵解升高，乙醛酸循環(huán)下降，這一能量代謝優(yōu)勢途徑的轉(zhuǎn)變可能與真菌耐藥性存在一定的關(guān)系。 本研究通過觀察MDH在耐伊曲康唑白念珠菌株與非耐藥株中表達的差異，探討白念珠菌MDH11p表達水平與唑類耐藥存在關(guān)系。通過對白念珠菌MDH交叉免疫反應(yīng)篩選其高度保守表位結(jié)構(gòu)，為探討白念珠菌新的藥物作用靶點和免疫特異診斷抗體提供理論基礎(chǔ)。 實驗?zāi)康模?探討白念珠菌MDH11p表達水平與唑類耐藥存在關(guān)系；確定LDH/MDH同源序列存在高度保守的表位結(jié)構(gòu)。 實驗方法： 1．CaMDH基因的全長cDNA序列生物信息學分析利用NCBI、ExPASy和DNAstar等生物信息學軟件包分析CaMDH氨基酸序列，，預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)與功能；并與常見病原微生物的同源氨基酸序列進行序列比對，構(gòu)建進化樹。 2．白念珠菌藥物敏感試驗及ELISA檢測MDH的表達水平初步藥敏篩選白念珠菌臨床分離株30株，以M27－A微量法藥敏試驗重復(fù)鑒定伊曲康唑耐藥株、中介株和敏感株各10株，應(yīng)用ELISA檢測比較CaMDH的表達水平，統(tǒng)計采用方差分析,P0.05具有統(tǒng)計學意義。 3．CaMDH的識別及與同源序列抗血清交叉免疫反應(yīng)白念珠菌總蛋白與SjLDH多克隆免疫血清反應(yīng)作Western印跡試驗。 實驗結(jié)果： CaMDH與其他物種同源氨基酸序列一致性可達43％，比對的同源序列中SjLDH一致性最低18.2%。CaMDH具有乳酸脫氫酶保守區(qū)域，8個主要的B細胞表位，蘋果酸脫氫酶活化點包含于NAD(P)結(jié)合部分中。 M27一A微量法藥敏試驗結(jié)果重復(fù)鑒定30株臨床白念珠菌藥敏MIC值，結(jié)果同前伊曲康唑耐藥株、中介株和敏感株各10株。 ELISA檢測耐藥株與LDH抗體相對結(jié)合量為348.7143±34.3594,中介株與LDH抗體相對結(jié)合量為327.0000±85.5990，敏感株與LDH抗體相對結(jié)合量為443.4286±35.6363.（F=8.516,P＝0.003）。 從氨基酸序列分析CaMDH與SjLDH有三處表位相似，可發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，CaMDH與SjLDH多克隆免疫血清Westernblot結(jié)果陽性。 實驗結(jié)論： 生物信息學分析白念珠菌MDH蛋白的結(jié)構(gòu)與功能與進化較高級生物的LDH蛋白更接近。 白念珠菌耐藥株MDH蛋白表達量較敏感菌株低，提示白念珠菌MDH表達水平與耐藥存在一定關(guān)系。 白念珠菌MDH與同源序列LDH抗血清發(fā)生交叉免疫結(jié)合，識別結(jié)合位點為LDH/MDH同源序列高度保守的抗原表位決定簇。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中山大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R379

【二級參考文獻】

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本文編號：2259471