【摘要】：隨著艾滋病、糖尿病等疾病的發(fā)病率不斷上升，器官移植及導(dǎo)管技術(shù)的推廣普及，臨床上免疫受損患者日益增多，念珠菌系統(tǒng)感染發(fā)病率大幅上升。臨床使用抗真菌藥物的頻率和劑量有明顯增加導(dǎo)致真菌耐藥情況變得越來(lái)越嚴(yán)重，尤其對(duì)唑類藥物的耐受，給有效控制日益增高的念珠菌系統(tǒng)感染帶來(lái)嚴(yán)重困難，也使白念珠菌耐藥發(fā)生影響因素研究具有重大意義。 耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)，白念珠菌對(duì)葡萄糖含量極之敏感，培養(yǎng)基中0.001％的葡萄糖濃度改變，都會(huì)引起菌株調(diào)節(jié)代謝的核心基因發(fā)生改變，對(duì)唑類藥物的耐藥性增加。而白念珠菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)以乙醛酸循環(huán)功能是該菌引起感染的關(guān)鍵。宿主巨噬細(xì)胞是一個(gè)葡萄糖，氨基酸等營(yíng)養(yǎng)缺乏的微環(huán)境，微生物無(wú)法利用三羧酸循環(huán)進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝。巨噬細(xì)胞內(nèi)白念珠菌調(diào)節(jié)氧化、乙醛酸循環(huán)、糖異生等代謝途徑的各個(gè)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，而糖酵解的關(guān)鍵酶則呈下調(diào)趨勢(shì)。因此我們推測(cè)，白念珠菌糖酵解升高，乙醛酸循環(huán)下降，這一能量代謝優(yōu)勢(shì)途徑的轉(zhuǎn)變可能與真菌耐藥性存在一定的關(guān)系。 本研究通過(guò)觀察MDH在耐伊曲康唑白念珠菌株與非耐藥株中表達(dá)的差異，探討白念珠菌MDH11p表達(dá)水平與唑類耐藥存在關(guān)系。通過(guò)對(duì)白念珠菌MDH交叉免疫反應(yīng)篩選其高度保守表位結(jié)構(gòu)，為探討白念珠菌新的藥物作用靶點(diǎn)和免疫特異診斷抗體提供理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?探討白念珠菌MDH11p表達(dá)水平與唑類耐藥存在關(guān)系；確定LDH/MDH同源序列存在高度保守的表位結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．CaMDH基因的全長(zhǎng)cDNA序列生物信息學(xué)分析利用NCBI、ExPASy和DNAstar等生物信息學(xué)軟件包分析CaMDH氨基酸序列，，預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能；并與常見病原微生物的同源氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。 2．白念珠菌藥物敏感試驗(yàn)及ELISA檢測(cè)MDH的表達(dá)水平初步藥敏篩選白念珠菌臨床分離株30株，以M27－A微量法藥敏試驗(yàn)重復(fù)鑒定伊曲康唑耐藥株、中介株和敏感株各10株，應(yīng)用ELISA檢測(cè)比較CaMDH的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)采用方差分析,P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．CaMDH的識(shí)別及與同源序列抗血清交叉免疫反應(yīng)白念珠菌總蛋白與SjLDH多克隆免疫血清反應(yīng)作Western印跡試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： CaMDH與其他物種同源氨基酸序列一致性可達(dá)43％，比對(duì)的同源序列中SjLDH一致性最低18.2%。CaMDH具有乳酸脫氫酶保守區(qū)域，8個(gè)主要的B細(xì)胞表位，蘋果酸脫氫酶活化點(diǎn)包含于NAD(P)結(jié)合部分中。 M27一A微量法藥敏試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)鑒定30株臨床白念珠菌藥敏MIC值，結(jié)果同前伊曲康唑耐藥株、中介株和敏感株各10株。 ELISA檢測(cè)耐藥株與LDH抗體相對(duì)結(jié)合量為348.7143±34.3594,中介株與LDH抗體相對(duì)結(jié)合量為327.0000±85.5990，敏感株與LDH抗體相對(duì)結(jié)合量為443.4286±35.6363.（F=8.516,P＝0.003）。 從氨基酸序列分析CaMDH與SjLDH有三處表位相似，可發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，CaMDH與SjLDH多克隆免疫血清Westernblot結(jié)果陽(yáng)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 生物信息學(xué)分析白念珠菌MDH蛋白的結(jié)構(gòu)與功能與進(jìn)化較高級(jí)生物的LDH蛋白更接近。 白念珠菌耐藥株MDH蛋白表達(dá)量較敏感菌株低，提示白念珠菌MDH表達(dá)水平與耐藥存在一定關(guān)系。 白念珠菌MDH與同源序列LDH抗血清發(fā)生交叉免疫結(jié)合，識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)DH/MDH同源序列高度保守的抗原表位決定簇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R379

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：2259471