【摘要】：目的煙草煙霧暴露可誘發(fā)肺部異常炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺氣腫,同時(shí)可以引起其他部位的炎癥,本文著重探討煙草煙霧對(duì)骨骼肌炎癥的影響。 方法48只雄性6個(gè)月齡大小的昆明小鼠隨機(jī)分為4組(每組12只)：12周正常對(duì)照組(A組),24周正常對(duì)照組(B組),12周煙霧暴露組(C組)；24周煙霧暴露組(D組)。通過(guò)單純長(zhǎng)期香煙煙霧被動(dòng)吸入方式建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察： (1)小鼠大體情況的變化；解剖后肺臟病理形態(tài)變化；小鼠煙霧暴露前后體重的變化； (2)骨骼肌的變化：①取肺組織及骨骼肌組織制作病理切片,觀察形態(tài)學(xué)改變；②取小鼠骨骼肌,通過(guò)蛋白印跡法(Western blot WB)檢測(cè)胞漿中肌球蛋白重鏈亞型Ⅱβ鏈(Myosin heavy chain isoforms-Ⅱ β MHC-Ⅱ β)的改變,來(lái)顯示肌纖維的變化。 (3)骨骼肌炎癥介質(zhì)的含量：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8IL-8)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α TNF-α)的濃度。 (4)骨骼肌炎癥調(diào)控基因的表達(dá)：①通過(guò)Western blot方法檢測(cè)組蛋白去乙�；�2(Histone deacetylase2HDAC2)蛋白的表達(dá)；②應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-PCR)法檢測(cè)HDAC2的mRNA表達(dá)；③通過(guò)Western blot方法檢測(cè)核因子-κB/P65(Nuclear factor-κ b/P65)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果(1)觀察大體情況,C、D組小鼠對(duì)比A、B組,煙霧暴露組均顯得毛發(fā)稀疏,無(wú)光澤,部分豎毛。吸煙12周后,C、D組小鼠體重偏低,與A、B組相比(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；吸煙24周后,D組小鼠與B組比較,煙霧暴露組體重更明顯偏低。解剖后觀察肺臟大體病理形態(tài)發(fā)現(xiàn)：煙霧暴露組肺體積比正常組膨大,邊緣鈍圓,表面可見(jiàn)多個(gè)大小不等的大泡,肺臟回縮較差。 (2)觀察香煙煙霧暴露小鼠肺組織病理切片發(fā)現(xiàn)：肺泡腔擴(kuò)大、部分肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合、肺組織肺大泡形成伴周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn),表明已形成肺氣腫模型。進(jìn)一步觀察小鼠骨骼肌組織病理切片發(fā)現(xiàn)：煙霧暴露組骨骼肌組織中有周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)伴隨肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,排列紊亂,局部性壞死病灶產(chǎn)生,表明肺氣腫小鼠骨骼肌炎癥模型已經(jīng)建立。Western blot法檢測(cè)A、B、C、D組小鼠骨骼肌組織中MHC-Ⅱβ鏈蛋白表達(dá)量分別為：1.2103±0.2197、1.1782±0.2046、1.1151±0.1956、0.6775±0.1645,正常對(duì)照組(A、B)、12周煙霧暴露組(C)與24周煙霧暴露組(D)之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明MHC-Ⅱβ鏈蛋白的表達(dá)量在煙霧暴露組要低于正常對(duì)照組。 (3) ELISA法檢測(cè)B、D組骨骼肌勻漿上清液中IL-8的平均濃度分別為：195.49和233.88,既工L-8濃度在煙霧暴露組大于正常對(duì)照組；檢測(cè)炎癥因子TNF-α的平均濃度為124.6651以及150.7417,既TNF-α濃度在煙霧暴露組大于正常對(duì)照組。 (4) RT-PCR法檢測(cè)B、D組HDAC2的mRNA表達(dá)水平,通過(guò)測(cè)定CT值,用Paff1法計(jì)算：煙霧暴露組／正常對(duì)照組(Median)=0.64,證實(shí)HDAC2的mRNA表達(dá)水平在煙霧暴露組要低于正常對(duì)照組。Western blot法檢測(cè)A、B、C、D組小鼠骨骼肌組織中HDAC2表達(dá)量分別為0.5942±0.1078、0.5366±0.2179、0.2978±0.1135、0.2290±0.0772,正常對(duì)照組(A、B)與12周煙霧暴露組和24周煙霧暴露組之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000),顯示HDAC2在煙霧暴露組明顯低于正常對(duì)照組；檢測(cè)NF-κB/P65蛋白表達(dá)量分別為：0.4901±0.2591、0.5166±0.2319、0.5263±0.2448、1.1230±0.3725,正常對(duì)照組(A、B)、12周煙霧暴露組與24周煙霧暴露組之間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.05),說(shuō)明NF-κB/P65蛋白表達(dá)量在煙霧暴露組要高于正常對(duì)照組。 結(jié)論：1、長(zhǎng)期煙草煙霧暴露可以導(dǎo)致小鼠骨骼肌細(xì)胞空泡樣變、萎縮及溶解,肌纖維中MHC-Ⅱ β鏈蛋白含量減少,顯示可以導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的改變 2、長(zhǎng)期煙草煙霧暴露可以導(dǎo)致骨骼肌炎癥因子(IL-8、TNF-α)及炎癥調(diào)控基因NF-κB活性明顯增強(qiáng)、HDAC2表達(dá)明顯減弱,顯示骨骼肌中存在著明顯的炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:Objective Tobacco smoke exposure can induce abnormal pulmonary inflammation and induce emphysema in other parts of the lung. This article focuses on the effect of tobacco smoke on skeletal muscle inflammation.
Methods 48 6-month-old male Kunming mice were randomly divided into 4 groups: 12-week normal control group (group A), 24-week normal control group (group B), 12-week smoke exposure group (group C) and 24-week smoke exposure group (group D).
(1) The changes of the general condition of the mice; the pathological changes of the lungs after dissection; the changes of the weight of the mice before and after exposure to smoke;
(2) Changes of skeletal muscle: 1) The lung and skeletal muscle tissues were taken to make pathological sections to observe the morphological changes; 2) The skeletal muscle of mice was taken to detect the changes of myosin heavy chain isoforms - II beta MHC - II beta in the cytoplasm by Western blot WB.
(3) Skeletal muscle inflammatory mediators: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the concentrations of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha).
(4) Expression of inflammation-regulating genes in skeletal muscle: 1. Histone deacetylase 2 (HDAC 2) protein was detected by Western blot; 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of HDAC 2 mRNA; 3. Western blot was used to detect the expression of HDAC 2 protein. The expression of nuclear factor kappa B/P65 (Nuclear factor- kappa b/P65) protein.
Results (1) After 12 weeks of smoking, the weight of mice in group C and D was lower than that in group A and B (P 0.05). After 24 weeks of smoking, the weight of mice in group D was lower than that in group B. The pulmonary gross pathological morphology showed that the lung volume of smoke exposure group was larger than that of normal group, with blunt edges, multiple bullae of different sizes on the surface and poor retraction of the lungs.
(2) Observing the pathological section of lung tissue of smoke exposed mice, it was found that alveolar cavity enlarged, part of alveolar septum ruptured, alveolar cavity fused, alveoli formed in lung tissue accompanied by infiltration of peripheral inflammatory cells, indicating that the model of emphysema had been formed. Peripheral inflammatory cell infiltration was accompanied by morphological and structural changes of myocytes, disordered arrangement, and localized necrosis, indicating that the model of skeletal muscle inflammation in emphysema mice had been established. The expression of MHC-II beta chain protein in skeletal muscle tissues of A, B, C, D mice was detected by Western blot: 1.2103 [0.2197], 1.1782 [0.2046], 1.1151 [0.1956], 0.6775 [0] respectively. 1645, normal control group (A, B), 12-week smoke exposure group (C) and 24-week smoke exposure group (D) were significantly different (P 0.05), indicating that the expression of MHC-II beta chain protein in the smoke exposure group was lower than the normal control group.
(3) The average concentrations of IL-8 in the supernatant of skeletal muscle homogenate of B and D groups were 195.49 and 233.88, respectively, which were higher in smoke exposure group than in normal control group, and 124.6651 and 150.7417, respectively, which were higher in smoke exposure group than in normal control group.
(4) RT-PCR was used to detect the expression of HDAC2 mRNA in the skeletal muscle tissues of mice in groups B, D and B. The expression of HDAC2 mRNA in the skeletal muscle tissues of mice in groups A, B, C and D was 0.5942 (+ 0.107) respectively. The expression of HDAC2 in smoke exposed group was significantly lower than that in normal control group (p=0.000), and the expression of NF-kappa B/P65 protein was 0.4901+0.2591, 0.5166+0.2319 and 0.5166+0.2319 respectively. The expression of NF-kappa B/P65 protein in smoke exposure group was higher than that in normal control group (A, B), 12-week smoke exposure group and 24-week smoke exposure group (P (0.05).
CONCLUSION: 1. Long-term tobacco smoke exposure can induce vacuole-like degeneration, atrophy and dissolution of skeletal muscle cells in mice, and decrease the content of MHC-II beta chain protein in muscle fibers, indicating that it can lead to changes of skeletal muscle structure and function.
2. Long-term tobacco smoke exposure can lead to increased activity of inflammatory factors (IL-8, TNF-a) and inflammation-regulating gene NF-kappa B in skeletal muscle, and decreased expression of HDAC2, indicating that there is an obvious inflammatory reaction in skeletal muscle.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2251326