【摘要】：目的：心血管疾病是目前世界上危害人類健康的主要疾患之一，具有極高的發(fā)病率。一旦發(fā)生急性心肌梗塞（acute myocardial infarction, AMI）或其他心臟病等，會(huì)造成功能性心肌細(xì)胞數(shù)量下降，瘢痕組織形成，心室發(fā)生重構(gòu)，從而導(dǎo)致心功能下降，甚至最終誘發(fā)心力衰竭而危及生命。采用細(xì)胞移植，將外源性的有功能細(xì)胞移植到梗死心肌，發(fā)揮其綜合生物學(xué)作用，從而改善心臟功能，這是個(gè)具有極大潛力的治療方法。在過(guò)去幾十年中，人類為尋找一種能夠修復(fù)損傷心肌、恢復(fù)心功能的干細(xì)胞投入了極大的熱情和努力，目前研究最多的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs）屬于成體干細(xì)胞（adult stem cells, ASCs），與其他干細(xì)胞相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：①可以自體移植，不涉及倫理道德問(wèn)題。②易于分離，體外培養(yǎng)具有高度的擴(kuò)增能力，并且在體外多次傳代后基因穩(wěn)定性良好。③具有多向分化潛能。④具有低免疫原性和可移植性。因此，BMSCs是用于心血管疾病干細(xì)胞移植治療的較理想的種子細(xì)胞。 BMSCs體外向心肌細(xì)胞分化的方法大致有三種：①藥物誘導(dǎo)；②與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)；③基因修飾。然而誘導(dǎo)效率低仍是目前存在的問(wèn)題，如何能夠提高誘導(dǎo)分化的效率成為科研人員研究的熱點(diǎn)。 對(duì)BMSCs進(jìn)行基因修飾，從分子水平促進(jìn)BMSCs的心肌細(xì)胞分化，是近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展而新興的誘導(dǎo)方法，旨在通過(guò)啟動(dòng)某個(gè)或某些關(guān)鍵基因，激活心肌分化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的目的。心臟早期轉(zhuǎn)錄因子在心臟發(fā)育早期表達(dá)，其中最主要的有Nkx2.5、GATA4、TBX5等，它們調(diào)控許多心臟結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)，對(duì)心臟正常發(fā)育具有十分重要的作用，曾被作為外源基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞等，促進(jìn)其向心肌細(xì)胞方向分化。 用于MSCs向心肌細(xì)胞分化的藥物誘導(dǎo)劑，文獻(xiàn)報(bào)道有5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、胰島素、地塞米松、抗壞血酸等。其中，5-aza是目前最常用的誘導(dǎo)劑，但作為腫瘤治療藥物也存在細(xì)胞毒性大等不利于臨床應(yīng)用的問(wèn)題。近年我們研究了一種人體激素——催產(chǎn)素（Oxytocin, OT）對(duì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)能力。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管方面，OT除了具有降壓等調(diào)節(jié)作用外，對(duì)于心臟的發(fā)生也具有一定影響。并且能夠誘導(dǎo)P19細(xì)胞、P19CL6細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、心臟來(lái)源的Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞、心旁細(xì)胞等多種細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。 本實(shí)驗(yàn)采用心臟早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5轉(zhuǎn)染BMSCs、誘導(dǎo)劑OT誘導(dǎo)或兩種方法聯(lián)合應(yīng)用，探討Nkx2.5、GATA4、TBX5對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的作用和影響，為實(shí)現(xiàn)BMSCs高效心肌細(xì)胞分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為干細(xì)胞移植修復(fù)心肌損傷提供良好的細(xì)胞來(lái)源。 方法： 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用貼壁分離篩選法與換液、嚴(yán)格控制消化時(shí)間的傳代方法結(jié)合，分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)SD大鼠BMSCs。從三個(gè)方面對(duì)分離擴(kuò)增培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行鑒定：（1）觀察培養(yǎng)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)特點(diǎn)；（2）流式細(xì)胞技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD90、CD29、CD45的表達(dá)情況；（3）體外誘導(dǎo)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化，檢測(cè)其多向分化潛能。 2外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 實(shí)驗(yàn)分組：A1組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5）、A2組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒）、A3組（空白組）；B1組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His）、B2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒）、B3組（空白組）；C1組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5）、C2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒）、C3組（空白組）。轉(zhuǎn)染前通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度、最佳轉(zhuǎn)染體系，采用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各組BMSCs。轉(zhuǎn)染后48h經(jīng)Western blot檢測(cè)各組外源基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4w，免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）、連接蛋白43（connexin43,Cx43）的表達(dá)。分別取P3BMSCs和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)1w、2w、3w、4w的細(xì)胞標(biāo)本，Real Time PCR檢測(cè)心肌相關(guān)基因Cx43、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain, β-MHC）、肌球蛋白輕鏈-2（myosin light chain-2,MLC-2）的表達(dá)。3外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5聯(lián)合催產(chǎn)素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 實(shí)驗(yàn)分組：①轉(zhuǎn)染組：又分為Nkx2.5組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5）、GATA4組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His）和TBX5組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5）；②轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組：又分為Nkx2.5+OT組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5+OT誘導(dǎo)）、 GATA4+OT組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His+OT誘導(dǎo)）、TBX5+OT組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5+OT誘導(dǎo)）；③單純藥物誘導(dǎo)組（OT誘導(dǎo)組）；④空白組。采用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各組BMSCs。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4w，免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞cTnT、Cx43的表達(dá)；透射電鏡技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 分離原代細(xì)胞48h首次換液后，貼壁細(xì)胞呈圓形、多角形、梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。3～4d后貼壁細(xì)胞分裂增殖迅速，相鄰細(xì)胞逐漸相互匯合，9～11d細(xì)胞匯合可達(dá)80%，呈旋渦狀或放射狀排列。傳代后BMSCs貼壁比原代細(xì)胞快，細(xì)胞呈均勻分布生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞換液和傳代，貼壁細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致；傳代至第3代時(shí)BMSCs形態(tài)基本單一，呈梭形。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)生長(zhǎng)良好的P3細(xì)胞中CD90+/CD29+/CD45-細(xì)胞達(dá)99%以上，說(shuō)明獲得的BMSCs具有較高的均一性，細(xì)胞純度較高。 BMSCs成脂誘導(dǎo)1w后，部分細(xì)胞內(nèi)有數(shù)量較多的小脂滴積聚，以后細(xì)胞中的脂滴變大、增多，含有大量脂滴的脂肪樣細(xì)胞逐漸增多；2w后，用脂肪特異性結(jié)合染料油紅O染色檢測(cè)，細(xì)胞胞質(zhì)中的脂滴被染為橘紅色。BMSCs成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，細(xì)胞逐漸匯合，排列緊密，呈鋪路石狀；2w后，用可以和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)的茜素紅進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞外基質(zhì)中有被染成紅色的鈣化點(diǎn)。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后，局部部分細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形，并且增殖迅速，聚集生長(zhǎng)；2w后，局部形成多個(gè)結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，用可將硫酸化蛋白聚糖染為藍(lán)色的阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)，將軟骨結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)染成藍(lán)色。 2外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：以4×10~4/cm~2密度傳代，在次日轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到90%～95%匯合；質(zhì)粒DNA（μg）和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μl)的比率為1:2.5，此條件下轉(zhuǎn)染可取得較好的效果。 轉(zhuǎn)染48h后，Western blot檢測(cè)A1、A2、A3各組Nkx2.5:EGFP融合蛋白表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組A1組有外源性Nkx2.5表達(dá)，而空質(zhì)粒組A2組、空白組A3組均無(wú)表達(dá)；檢測(cè)B1、B2、B3各組myc蛋白表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組B1組有外源性GATA4表達(dá)，而空質(zhì)粒組B2組、空白組B3組均無(wú)表達(dá)；檢測(cè)C1、C2、C3各組TBX5蛋白表達(dá)，結(jié)果表明三組均有TBX5表達(dá)，，其中轉(zhuǎn)染組C1組比空質(zhì)粒組C2組、空白組C3組TBX5表達(dá)顯著增高（P0.05）。證明脂質(zhì)體能夠成功介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA-4/myc-His、pcDNA3.1-TBX5轉(zhuǎn)染BMSCs。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后形態(tài)學(xué)觀察，A1組、B1組、C1組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞增大、增寬，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，局部細(xì)胞密集重疊生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，細(xì)胞不再增殖，各組細(xì)胞形態(tài)改變相似；A2組、A3組、B2組、B3組和C2組、C3組細(xì)胞也有局部少量細(xì)胞密集重疊生長(zhǎng)。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明：A1組、B1組、C1組部分細(xì)胞呈cTnT陽(yáng)性，cTnT陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色絲網(wǎng)狀及顆粒樣結(jié)構(gòu)，以局部密集重疊生長(zhǎng)部及放射周邊的細(xì)胞中cTnT呈強(qiáng)陽(yáng)性。A1組、B1組、C1組部分細(xì)胞呈Cx43陽(yáng)性，Cx43陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)棕褐色顆粒，以局部密集重疊生長(zhǎng)部及放射周邊的細(xì)胞中Cx43呈強(qiáng)陽(yáng)性。A2組、A3組、B2組、B3組和C2組、C3組只有少量細(xì)胞cTnT、Cx43表達(dá)陽(yáng)性。各組進(jìn)行積分吸光度（IA）值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：A1組、A2組、A3組比較，轉(zhuǎn)染組A1組cTnT、Cx43表達(dá)最高，空質(zhì)粒A2組、空白組A3組cTnT、Cx43表達(dá)較低，與A1組相比均有顯著差異（P0.05）；B1組、B2組、B3組比較，轉(zhuǎn)染組B1組cTnT、Cx43表達(dá)最高，空質(zhì)粒B2組、空白組B3組cTnT、Cx43表達(dá)較低，與B1組相比均有顯著差異（P0.05）；C1組、C2組、C3組比較，轉(zhuǎn)染組C1組cTnT、Cx43表達(dá)最高，空質(zhì)粒C2組、空白組C3組cTnT、Cx43表達(dá)較低，與C1組相比均有顯著差異（P0.05）。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組cTnT蛋白呈明顯高表達(dá)，空質(zhì)粒組、空白組幾乎無(wú)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)cTnT檢測(cè)結(jié)果一致。 Real Time PCR結(jié)果顯示： A1、B1、C1組Cx43表達(dá)水平趨勢(shì)變化相似，均于第1w開(kāi)始逐漸增高，第2w或3w時(shí)表達(dá)最高，之后表達(dá)回落。β-MHC在A1組表達(dá)水平于第1w至第3w時(shí)顯著高于P3BMSCs（P0.05），第4w時(shí)表達(dá)減弱，與P3BMSCs比較無(wú)差異（P0.05）；B1組β-MHC表達(dá)水平第1w、第2w時(shí)與P3BMSCs間均無(wú)顯著差異（P0.05），第3w時(shí)表達(dá)顯著增高，與P3BMSCs有顯著差異（P0.05），第4w時(shí)回落，與P3BMSCs無(wú)顯著差異（P0.05）；β-MHC在C1組表達(dá)水平從第1w開(kāi)始呈逐漸增高趨勢(shì)，第4w時(shí)表達(dá)最高，但前3w與P3BMSCs組比較無(wú)差異（P0.05），第4w時(shí)表達(dá)與P3BMSCs比較有顯著差異（P0.05）。MLC-2表達(dá)水平在A1、C1組第1w時(shí)與P3BMSCs比較無(wú)顯著差異（P0.05），第2w時(shí)表達(dá)顯著增高，至第3w時(shí)逐漸回落，與P3BMSCs比較有顯著差異（P0.05），第4w時(shí)表達(dá)減弱；B1組MLC-2表達(dá)水平第1w、2w時(shí)與P3BMSCs比較均無(wú)顯著差異（P0.05），第3w時(shí)顯著增高，與P3BMSCs有顯著差異（P0.05），第4w時(shí)回落，與P3BMSCs間比較無(wú)顯著差異（P0.05）。3外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5聯(lián)合催產(chǎn)素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組及OT誘導(dǎo)組細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞增大、增寬，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，局部細(xì)胞密集重疊生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，細(xì)胞不再增殖，各組細(xì)胞形態(tài)改變相似；空白組細(xì)胞也有局部少量細(xì)胞密集重疊生長(zhǎng)。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)cTnT、Cx43表達(dá)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組（Nkx2.5組、GATA4組、TBX5組）、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組（Nkx2.5+OT組、GATA4+OT組、TBX5+OT組）、OT誘導(dǎo)組部分細(xì)胞呈cTnT陽(yáng)性，cTnT陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色絲網(wǎng)狀及顆粒樣結(jié)構(gòu)，以局部密集重疊生長(zhǎng)部及放射周邊的細(xì)胞中cTnT呈強(qiáng)陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組、OT誘導(dǎo)組部分細(xì)胞呈Cx43陽(yáng)性，Cx43陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)棕褐色顆粒，以局部密集重疊生長(zhǎng)部及放射周邊的細(xì)胞中Cx43呈強(qiáng)陽(yáng)性。空白組只有少量細(xì)胞cTnT、Cx43表達(dá)陽(yáng)性。各組積分吸光度（IA）值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組(Nkx2.5組、GATA4組、TBX5組)、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組（Nkx2.5+OT組、GATA4+OT組、TBX5+OT組）、OT誘導(dǎo)組、空白組比較，cTnT在轉(zhuǎn)染組呈明顯的高表達(dá)，轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組表達(dá)最高，OT誘導(dǎo)組也有較高表達(dá)，空白組僅有少量表達(dá)，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）；Cx43表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組均較高， OT誘導(dǎo)組也有明顯表達(dá)，空白組僅有少量表達(dá)，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組cTnT蛋白表達(dá)最高，轉(zhuǎn)染組呈明顯的高表達(dá)，OT誘導(dǎo)組也有較明顯表達(dá)，空白組幾乎無(wú)表達(dá)，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)cTnT檢測(cè)結(jié)果一致。 透射電鏡下可見(jiàn)未轉(zhuǎn)染的P3BMSCs和空白組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器較豐富，可見(jiàn)較多核糖體及線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等，少數(shù)細(xì)胞間偶見(jiàn)縫隙連接。轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組和OT誘導(dǎo)組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈卵圓形，較大，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)較多線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等；細(xì)胞核周的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一些平行排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞周邊突起和細(xì)胞末端可見(jiàn)大量密集排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)，隱約可見(jiàn)電子密度高與電子密度低區(qū)域交錯(cuò)排列；細(xì)胞側(cè)面或細(xì)胞末端可見(jiàn)較多明顯的縫隙連接。其中，轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)肌絲樣結(jié)構(gòu)和縫隙連接更多、更明顯，OT誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)肌絲樣結(jié)構(gòu)和縫隙連接相對(duì)較少。 結(jié)論： 1成功分離、擴(kuò)增及鑒定了SD大鼠BMSCs。 2應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA-4/myc-His、pcDNA3.1-TBX5成功轉(zhuǎn)染入SD大鼠BMSCs。 3SD大鼠BMSCs分別轉(zhuǎn)染心臟早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5后，能夠促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，在基因和蛋白水平表達(dá)心肌源性特異標(biāo)志物cTnT、Cx43、β-MHC、MLC-2，具有發(fā)育早期的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 4OT作為誘導(dǎo)劑能夠促進(jìn)SD大鼠BMSCs向心肌細(xì)胞分化，具有發(fā)育早期心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 5心臟早期轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染+OT誘導(dǎo)聯(lián)合應(yīng)用，有促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化的疊加效應(yīng)，cTnT蛋白表達(dá)水平有較明顯增高，但Cx43蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 卞云飛;高糖或缺氧對(duì)原代心肌細(xì)胞Nkx2-5、Tbx5表達(dá)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2251040