【摘要】：目的：心血管疾病是目前世界上危害人類健康的主要疾患之一，具有極高的發(fā)病率。一旦發(fā)生急性心肌梗塞（acute myocardial infarction, AMI）或其他心臟病等，會造成功能性心肌細胞數(shù)量下降，瘢痕組織形成，心室發(fā)生重構(gòu)，從而導(dǎo)致心功能下降，甚至最終誘發(fā)心力衰竭而危及生命。采用細胞移植，將外源性的有功能細胞移植到梗死心肌，發(fā)揮其綜合生物學(xué)作用，從而改善心臟功能，這是個具有極大潛力的治療方法。在過去幾十年中，人類為尋找一種能夠修復(fù)損傷心肌、恢復(fù)心功能的干細胞投入了極大的熱情和努力，目前研究最多的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs）屬于成體干細胞（adult stem cells, ASCs），與其他干細胞相比具有明顯的優(yōu)勢：①可以自體移植，不涉及倫理道德問題。②易于分離，體外培養(yǎng)具有高度的擴增能力，并且在體外多次傳代后基因穩(wěn)定性良好。③具有多向分化潛能。④具有低免疫原性和可移植性。因此，BMSCs是用于心血管疾病干細胞移植治療的較理想的種子細胞。 BMSCs體外向心肌細胞分化的方法大致有三種：①藥物誘導(dǎo)；②與心肌細胞共培養(yǎng)；③基因修飾。然而誘導(dǎo)效率低仍是目前存在的問題，如何能夠提高誘導(dǎo)分化的效率成為科研人員研究的熱點。 對BMSCs進行基因修飾，從分子水平促進BMSCs的心肌細胞分化，是近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展而新興的誘導(dǎo)方法，旨在通過啟動某個或某些關(guān)鍵基因，激活心肌分化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)BMSCs向心肌細胞分化的目的。心臟早期轉(zhuǎn)錄因子在心臟發(fā)育早期表達，其中最主要的有Nkx2.5、GATA4、TBX5等，它們調(diào)控許多心臟結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達，對心臟正常發(fā)育具有十分重要的作用，曾被作為外源基因?qū)肱咛ジ杉毎�，促進其向心肌細胞方向分化。 用于MSCs向心肌細胞分化的藥物誘導(dǎo)劑，文獻報道有5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、胰島素、地塞米松、抗壞血酸等。其中，5-aza是目前最常用的誘導(dǎo)劑，但作為腫瘤治療藥物也存在細胞毒性大等不利于臨床應(yīng)用的問題。近年我們研究了一種人體激素——催產(chǎn)素（Oxytocin, OT）對干細胞向心肌細胞分化的誘導(dǎo)能力。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管方面，OT除了具有降壓等調(diào)節(jié)作用外，對于心臟的發(fā)生也具有一定影響。并且能夠誘導(dǎo)P19細胞、P19CL6細胞、胚胎干細胞、心臟來源的Sca-1陽性細胞、心旁細胞等多種細胞向心肌細胞分化。 本實驗采用心臟早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5轉(zhuǎn)染BMSCs、誘導(dǎo)劑OT誘導(dǎo)或兩種方法聯(lián)合應(yīng)用，探討Nkx2.5、GATA4、TBX5對BMSCs向心肌細胞分化的作用和影響，為實現(xiàn)BMSCs高效心肌細胞分化提供實驗依據(jù)，為干細胞移植修復(fù)心肌損傷提供良好的細胞來源。 方法： 1骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用貼壁分離篩選法與換液、嚴格控制消化時間的傳代方法結(jié)合，分離、純化、擴增培養(yǎng)SD大鼠BMSCs。從三個方面對分離擴增培養(yǎng)的BMSCs進行鑒定：（1）觀察培養(yǎng)細胞的黏附生長特點；（2）流式細胞技術(shù)聯(lián)合檢測細胞表面分子CD90、CD29、CD45的表達情況；（3）體外誘導(dǎo)細胞向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞分化，檢測其多向分化潛能。 2外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化 實驗分組：A1組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5）、A2組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒）、A3組（空白組）；B1組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His）、B2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒）、B3組（空白組）；C1組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5）、C2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒）、C3組（空白組）。轉(zhuǎn)染前通過預(yù)實驗確定最佳細胞轉(zhuǎn)染密度、最佳轉(zhuǎn)染體系，采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各組BMSCs。轉(zhuǎn)染后48h經(jīng)Western blot檢測各組外源基因表達。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4w，免疫細胞化學(xué)、Western blot檢測各組細胞心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）、連接蛋白43（connexin43,Cx43）的表達。分別取P3BMSCs和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)1w、2w、3w、4w的細胞標本，Real Time PCR檢測心肌相關(guān)基因Cx43、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain, β-MHC）、肌球蛋白輕鏈-2（myosin light chain-2,MLC-2）的表達。3外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5聯(lián)合催產(chǎn)素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化 實驗分組：①轉(zhuǎn)染組：又分為Nkx2.5組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5）、GATA4組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His）和TBX5組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5）；②轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組：又分為Nkx2.5+OT組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Nkx2.5+OT誘導(dǎo)）、 GATA4+OT組（轉(zhuǎn)染pVP22-GATA-4/myc-His+OT誘導(dǎo)）、TBX5+OT組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TBX5+OT誘導(dǎo)）；③單純藥物誘導(dǎo)組（OT誘導(dǎo)組）；④空白組。采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染各組BMSCs。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4w，免疫細胞化學(xué)、Western blot檢測各組細胞cTnT、Cx43的表達；透射電鏡技術(shù)檢測各組細胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 分離原代細胞48h首次換液后，貼壁細胞呈圓形、多角形、梭形，細胞生長緩慢。3～4d后貼壁細胞分裂增殖迅速，相鄰細胞逐漸相互匯合，9～11d細胞匯合可達80%，呈旋渦狀或放射狀排列。傳代后BMSCs貼壁比原代細胞快，細胞呈均勻分布生長。隨著細胞換液和傳代，貼壁細胞形態(tài)逐漸趨于一致；傳代至第3代時BMSCs形態(tài)基本單一，呈梭形。 流式細胞儀檢測生長良好的P3細胞中CD90+/CD29+/CD45-細胞達99%以上，說明獲得的BMSCs具有較高的均一性，細胞純度較高。 BMSCs成脂誘導(dǎo)1w后，部分細胞內(nèi)有數(shù)量較多的小脂滴積聚，以后細胞中的脂滴變大、增多，含有大量脂滴的脂肪樣細胞逐漸增多；2w后，用脂肪特異性結(jié)合染料油紅O染色檢測，細胞胞質(zhì)中的脂滴被染為橘紅色。BMSCs成骨誘導(dǎo)后，細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，細胞逐漸匯合，排列緊密，呈鋪路石狀；2w后，用可以和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)的茜素紅進行細胞化學(xué)染色，細胞外基質(zhì)中有被染成紅色的鈣化點。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后，局部部分細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形，并且增殖迅速，聚集生長；2w后，局部形成多個結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，用可將硫酸化蛋白聚糖染為藍色的阿爾新藍染色檢測，將軟骨結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)染成藍色。 2外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化 通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)：以4×10~4/cm~2密度傳代，在次日轉(zhuǎn)染時達到90%～95%匯合；質(zhì)粒DNA（μg）和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μl)的比率為1:2.5，此條件下轉(zhuǎn)染可取得較好的效果。 轉(zhuǎn)染48h后，Western blot檢測A1、A2、A3各組Nkx2.5:EGFP融合蛋白表達，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組A1組有外源性Nkx2.5表達，而空質(zhì)粒組A2組、空白組A3組均無表達；檢測B1、B2、B3各組myc蛋白表達，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組B1組有外源性GATA4表達，而空質(zhì)粒組B2組、空白組B3組均無表達；檢測C1、C2、C3各組TBX5蛋白表達，結(jié)果表明三組均有TBX5表達，，其中轉(zhuǎn)染組C1組比空質(zhì)粒組C2組、空白組C3組TBX5表達顯著增高（P0.05）。證明脂質(zhì)體能夠成功介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA-4/myc-His、pcDNA3.1-TBX5轉(zhuǎn)染BMSCs。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后形態(tài)學(xué)觀察，A1組、B1組、C1組細胞呈長梭形，部分細胞增大、增寬，隨著培養(yǎng)時間延長，局部細胞密集重疊生長，當(dāng)細胞密度達到一定程度后，細胞不再增殖，各組細胞形態(tài)改變相似；A2組、A3組、B2組、B3組和C2組、C3組細胞也有局部少量細胞密集重疊生長。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果表明：A1組、B1組、C1組部分細胞呈cTnT陽性，cTnT陽性細胞的胞質(zhì)中可見棕黃色絲網(wǎng)狀及顆粒樣結(jié)構(gòu)，以局部密集重疊生長部及放射周邊的細胞中cTnT呈強陽性。A1組、B1組、C1組部分細胞呈Cx43陽性，Cx43陽性細胞的胞質(zhì)中可見棕褐色顆粒，以局部密集重疊生長部及放射周邊的細胞中Cx43呈強陽性。A2組、A3組、B2組、B3組和C2組、C3組只有少量細胞cTnT、Cx43表達陽性。各組進行積分吸光度（IA）值統(tǒng)計結(jié)果顯示：A1組、A2組、A3組比較，轉(zhuǎn)染組A1組cTnT、Cx43表達最高，空質(zhì)粒A2組、空白組A3組cTnT、Cx43表達較低，與A1組相比均有顯著差異（P0.05）；B1組、B2組、B3組比較，轉(zhuǎn)染組B1組cTnT、Cx43表達最高，空質(zhì)粒B2組、空白組B3組cTnT、Cx43表達較低，與B1組相比均有顯著差異（P0.05）；C1組、C2組、C3組比較，轉(zhuǎn)染組C1組cTnT、Cx43表達最高，空質(zhì)粒C2組、空白組C3組cTnT、Cx43表達較低，與C1組相比均有顯著差異（P0.05）。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組cTnT蛋白呈明顯高表達，空質(zhì)粒組、空白組幾乎無表達。統(tǒng)計結(jié)果與免疫細胞化學(xué)cTnT檢測結(jié)果一致。 Real Time PCR結(jié)果顯示： A1、B1、C1組Cx43表達水平趨勢變化相似，均于第1w開始逐漸增高，第2w或3w時表達最高，之后表達回落。β-MHC在A1組表達水平于第1w至第3w時顯著高于P3BMSCs（P0.05），第4w時表達減弱，與P3BMSCs比較無差異（P0.05）；B1組β-MHC表達水平第1w、第2w時與P3BMSCs間均無顯著差異（P0.05），第3w時表達顯著增高，與P3BMSCs有顯著差異（P0.05），第4w時回落，與P3BMSCs無顯著差異（P0.05）；β-MHC在C1組表達水平從第1w開始呈逐漸增高趨勢，第4w時表達最高，但前3w與P3BMSCs組比較無差異（P0.05），第4w時表達與P3BMSCs比較有顯著差異（P0.05）。MLC-2表達水平在A1、C1組第1w時與P3BMSCs比較無顯著差異（P0.05），第2w時表達顯著增高，至第3w時逐漸回落，與P3BMSCs比較有顯著差異（P0.05），第4w時表達減弱；B1組MLC-2表達水平第1w、2w時與P3BMSCs比較均無顯著差異（P0.05），第3w時顯著增高，與P3BMSCs有顯著差異（P0.05），第4w時回落，與P3BMSCs間比較無顯著差異（P0.05）。3外源基因Nkx2.5、GATA4、TBX5聯(lián)合催產(chǎn)素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組及OT誘導(dǎo)組細胞均呈長梭形，部分細胞增大、增寬，隨著培養(yǎng)時間延長，局部細胞密集重疊生長，當(dāng)細胞密度達到一定程度后，細胞不再增殖，各組細胞形態(tài)改變相似；空白組細胞也有局部少量細胞密集重疊生長。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，免疫細胞化學(xué)檢測cTnT、Cx43表達結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組（Nkx2.5組、GATA4組、TBX5組）、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組（Nkx2.5+OT組、GATA4+OT組、TBX5+OT組）、OT誘導(dǎo)組部分細胞呈cTnT陽性，cTnT陽性細胞的胞質(zhì)中可見棕黃色絲網(wǎng)狀及顆粒樣結(jié)構(gòu)，以局部密集重疊生長部及放射周邊的細胞中cTnT呈強陽性。轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組、OT誘導(dǎo)組部分細胞呈Cx43陽性，Cx43陽性細胞的胞質(zhì)中可見棕褐色顆粒，以局部密集重疊生長部及放射周邊的細胞中Cx43呈強陽性。空白組只有少量細胞cTnT、Cx43表達陽性。各組積分吸光度（IA）值統(tǒng)計結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組(Nkx2.5組、GATA4組、TBX5組)、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組（Nkx2.5+OT組、GATA4+OT組、TBX5+OT組）、OT誘導(dǎo)組、空白組比較，cTnT在轉(zhuǎn)染組呈明顯的高表達，轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組表達最高，OT誘導(dǎo)組也有較高表達，空白組僅有少量表達，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）；Cx43表達水平在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組均較高， OT誘導(dǎo)組也有明顯表達，空白組僅有少量表達，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）。 外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4w后，Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組cTnT蛋白表達最高，轉(zhuǎn)染組呈明顯的高表達，OT誘導(dǎo)組也有較明顯表達，空白組幾乎無表達，各誘導(dǎo)組與空白組之間比較均有顯著差異（P0.05）。統(tǒng)計結(jié)果與免疫細胞化學(xué)cTnT檢測結(jié)果一致。 透射電鏡下可見未轉(zhuǎn)染的P3BMSCs和空白組細胞呈長梭形，細胞質(zhì)中細胞器較豐富，可見較多核糖體及線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等，少數(shù)細胞間偶見縫隙連接。轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組和OT誘導(dǎo)組細胞呈梭形，細胞核呈卵圓形，較大，位于細胞中央，細胞質(zhì)中細胞器豐富，可見較多線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等；細胞核周的細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一些平行排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)，部分細胞周邊突起和細胞末端可見大量密集排列的肌絲樣結(jié)構(gòu)，隱約可見電子密度高與電子密度低區(qū)域交錯排列；細胞側(cè)面或細胞末端可見較多明顯的縫隙連接。其中，轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染+藥物誘導(dǎo)組細胞內(nèi)肌絲樣結(jié)構(gòu)和縫隙連接更多、更明顯，OT誘導(dǎo)組細胞內(nèi)肌絲樣結(jié)構(gòu)和縫隙連接相對較少。 結(jié)論： 1成功分離、擴增及鑒定了SD大鼠BMSCs。 2應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA-4/myc-His、pcDNA3.1-TBX5成功轉(zhuǎn)染入SD大鼠BMSCs。 3SD大鼠BMSCs分別轉(zhuǎn)染心臟早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5后，能夠促進BMSCs向心肌細胞分化，在基因和蛋白水平表達心肌源性特異標志物cTnT、Cx43、β-MHC、MLC-2，具有發(fā)育早期的心肌細胞結(jié)構(gòu)特點。 4OT作為誘導(dǎo)劑能夠促進SD大鼠BMSCs向心肌細胞分化，具有發(fā)育早期心肌細胞結(jié)構(gòu)特點。 5心臟早期轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染+OT誘導(dǎo)聯(lián)合應(yīng)用，有促進BMSCs向心肌細胞方向分化的疊加效應(yīng)，cTnT蛋白表達水平有較明顯增高，但Cx43蛋白表達沒有明顯變化。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 卞云飛;高糖或缺氧對原代心肌細胞Nkx2-5、Tbx5表達的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號：2251040