【摘要】：研究背景: 吸煙是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素,可導(dǎo)致冠心病、腦血管疾病、主動(dòng)脈瘤、外周血管等疾病。據(jù)報(bào)道2000年世界范圍內(nèi)約有160萬心血管患者死亡直接由吸煙引起。研究表明吸煙通過促進(jìn)內(nèi)皮功能紊亂、增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、增加氧化應(yīng)激、促使心肌能量代謝障礙以及促進(jìn)血栓形成等來影響心血管系統(tǒng),而戒煙能降低冠心病、心臟驟停、卒中的風(fēng)險(xiǎn),并改善外周血管癥狀。 尼古丁作為煙草中的主要毒性物質(zhì),在由吸煙引起的各種心血管疾病的發(fā)展過程中起著極為重要的作用。然而尼古丁引起血管內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制仍不清楚。 以往研究主要集中在煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nACHR)及其下游的機(jī)制。體外研究發(fā)現(xiàn)尼古丁通過nACHR介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管新生,在體研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可以介導(dǎo)血管新生,而這種生血管效應(yīng)可導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性和斑塊的進(jìn)一步發(fā)展、腫瘤的生長及腫瘤血管的形成及其他吸煙相關(guān)的疾病。也有報(bào)道吸煙者體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度激活,而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的表達(dá),改善吸煙患者的內(nèi)皮功能,從而減輕尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害。因此我們?cè)O(shè)想尼古丁可能通過除nACHR之外的受體,如血管緊張素II受體1(angiotensin II receptor 1, AT1R)引起內(nèi)皮功能紊亂。因此本課題擬觀察尼古丁對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞AT1R表達(dá)的影響,以及尼古丁通過AT1R對(duì)內(nèi)皮功能的改變。 目的: 1.探討尼古丁對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞AT1R表達(dá)的影響。 2.探討尼古丁對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS及ICAM-1表達(dá)的影響。 3.探討運(yùn)用氯沙坦抑制AT1受體及siRNA沉默AT1R,觀察尼古丁對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS和ICAM-1表達(dá)的影響有無改變。 方法: 培養(yǎng)HUVEC并進(jìn)行傳代,觀察10~(-6)M尼古丁干預(yù)不同時(shí)間(0h、2h、6h、12h、18h、24h)細(xì)胞膜上AT1R和細(xì)胞內(nèi)eNOS及ICAM-1的表達(dá)變化趨勢(shì);分別選取24h AT1R變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)以及12h eNOS和ICAM-1都有顯著性差異的時(shí)間點(diǎn)再以0、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)M尼古丁干預(yù)HUVEC觀察細(xì)胞膜上AT1R和細(xì)胞內(nèi)eNOS和ICAM-1的表達(dá)變化。按上述實(shí)驗(yàn)得到尼古丁干預(yù)HUVEC引起AT1R、eNOS和ICAM-1變化最顯著的時(shí)間和濃度點(diǎn)后又將實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組、尼古丁干預(yù)組、氯沙坦+尼古丁干預(yù)組、AT1R siRNA干擾+尼古丁干預(yù)組,用western blot方法檢測(cè)eNOS及ICAM-1的表達(dá)情況。采用SPSS18.0軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示,不同處理組間比較采用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.用0、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)M尼古丁干預(yù)HUVEC 24小時(shí)可見細(xì)胞AT1R含量隨尼古丁濃度增加而逐漸增多,10~(-8)和10~(-7)M尼古丁干預(yù)細(xì)胞后AT1含量與對(duì)照組比較無顯著性差異,10~(-6)M尼古丁干預(yù)后AT1含量與對(duì)照組相比有顯著性改變(p㩳0.05)。10~(-6)M尼古丁干預(yù)HUVEC 2小時(shí)即可見細(xì)胞膜上AT1R受體含量的增高,且在24小時(shí)內(nèi)隨著時(shí)間延長,AT1含量逐漸增多。 2.10~(-6)M尼古丁干預(yù)HUVEC 6小時(shí)出現(xiàn)eNOS的增加,在12小時(shí)達(dá)高峰,并持續(xù)至18小時(shí),然后逐漸降低;2小時(shí)出現(xiàn)ICAM-1的增加,在6小時(shí)達(dá)高峰,然后逐漸降低,18小時(shí)后與對(duì)照組無顯著性差異。同時(shí)用0、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)M尼古丁干預(yù)HUVEC 12小時(shí)可見隨尼古丁濃度的增加,eNOS與ICAM-1含量均逐漸增加。 3.10~(-7)M氯沙坦或siRNA沉默HUVEC中的AT1R,,可減少10~(-6)M尼古丁引起的HUVEC eNOS的高表達(dá),但對(duì)ICAM-1無影響。 結(jié)論: AT1受體在尼古丁所致內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:Research background:
Smoking is an important risk factor for cardiovascular disease, which can lead to coronary heart disease, cerebrovascular disease, aortic aneurysm, peripheral blood vessels and other diseases. It is reported that about 1.6 million deaths of cardiovascular patients worldwide in 2000 were directly caused by smoking. Dysfunction of muscle energy metabolism and promotion of thrombosis affect the cardiovascular system, while smoking cessation reduces the risk of coronary heart disease, cardiac arrest, stroke, and improves peripheral vascular symptoms.
As a major toxic substance in tobacco, nicotine plays an important role in the development of various cardiovascular diseases caused by smoking. However, the mechanism of nicotine-induced vascular endothelial dysfunction remains unclear.
Previous studies have focused on nicotinic acetylcholine receptor (nACHR) and its downstream mechanism. In vitro studies have shown that nicotine mediates endothelial cell proliferation, migration and angiogenesis through nACHR. In vivo studies have shown that nicotine can mediate angiogenesis, and this angiogenic effect can lead to atherosclerotic plaque. There are also reports of over-activation of the renin-angiotensin-aldosterone system in smokers. Angiotensin-converting enzyme inhibitors can inhibit oxidative stress response and modulate the expression of eNOS in endothelial cells. Therefore, we hypothesized that nicotine may cause endothelial dysfunction through receptors other than nACHR, such as angiotensin II receptor 1 (AT1R). Therefore, we intend to observe the effect of nicotine on the expression of AT1R in endothelial cells. And nicotine through AT1R on endothelial function changes.
Objective:
1. to investigate the effect of nicotine on AT1R expression in human umbilical vein endothelial cells.
2. to investigate the effect of nicotine on the expression of eNOS and ICAM-1 in human umbilical vein endothelial cells.
3. To observe the effect of nicotine on the expression of eNOS and ICAM-1 in human umbilical vein endothelial cells by inhibiting AT1 receptor and siRNA silencing of AT1R with losartan.
Method:
The expression of AT1R and intracellular eNOS and ICAM-1 in HUVEC were observed at different intervals (0h, 2h, 6h, 12h, 18h, 24h) after 10~(-6) M nicotine treatment. The expression of AT1R and intracellular eNOS and ICAM-1 in HUVEC were observed by intervention with nicotine. According to the above experiment, the time and concentration of the most significant changes of AT1R, eNOS and ICAM-1 induced by nicotine intervention in HUVEC were randomly divided into control group, nicotine intervention group, losartan + Nicotine intervention group, AT1R siRNA interference + Nicotine intervention group. Western blot was used to detect the expression of eNOS and ICAM-1. SPSS18.0 software was used to analyze the data. Mean (+ SD) was used to express the data. One-way ANOVA was used to analyze the difference between different treatment groups. P 0.05 showed that the difference was statistically significant.
Result:
1. The AT1R content of HUVEC treated with 0,10-8,10-7,10-6 M nicotine increased with the increase of nicotine concentration in 24 hours. There was no significant difference in AT1 content between the two groups after 10-8 and 10-7 M nicotine treatment. The AT1 content of HUVEC treated with 10-6 M nicotine had significant change compared with the control group (p?0.05). The content of AT1R receptor on HUVEC membrane increased after 2 hours of nicotine treatment, and the content of AT1 increased gradually with the prolongation of 24 hours.
2.10-6 M nicotine increased eNOS at 6 hours, peaked at 12 hours, lasted to 18 hours, and then gradually decreased; 2 hours increased ICAM-1 at 6 hours, then decreased gradually, after 18 hours, there was no significant difference between the two groups. At the same time, 0,10-8, 10-7, 10-6 M nicotine intervened HUVEC for 12 hours. With the increase of nicotine concentration, the contents of eNOS and ICAM-1 gradually increased.
3.10~(-7) M losartan or siRNA silencing AT1R in HUVEC decreased the high expression of HUVEC eNOS induced by 10~(-6) M nicotine, but had no effect on ICAM-1.
Conclusion:
AT1 receptors play a role in nicotine induced endothelial dysfunction.
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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