【摘要】：衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)是指隨細胞衰老而出現(xiàn)的分泌功能亢進,其分泌的因子參與細胞衰老、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、細胞增殖及腫瘤侵襲等過程。與人類細胞相比,目前小鼠細胞的體外SASP模型尚十分缺乏,而建立該模型將為研究SASP的發(fā)生機制及生物學(xué)作用提供便利。為此,本文以INK4a基因座缺失(編碼p16INK4a蛋白)的小鼠NIH-3T3細胞系及野生型小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)為研究對象,用絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)誘導(dǎo)細胞DNA損傷,并通過細胞形態(tài)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色、Ed U整合率、Western blot、定量RT-PCR及ELISA等檢測方法,觀察細胞的衰老情況及SASP因子的表達和分泌水平。結(jié)果顯示,MMC(1μg/m L)處理12 h或24 h,并繼續(xù)培養(yǎng)到第8天后,NIH-3T3細胞體積變大,β-gal染色陽性(藍染)細胞的百分率明顯升高,分別達到77.4%和90.4%,并伴有P21蛋白表達上調(diào)及Ed U整合率下降(P0.01)。同時,IL-6、TNF-α、IL-1α和IL-1β等常見SASP基因的m RNA表達水平顯著上調(diào),ELISA檢測證明IL-6的分泌量亦顯著升高(P0.01)。相反,盡管MMC處理12 h或24 h也能誘導(dǎo)野生型MEF出現(xiàn)細胞體積增大、β-gal染色陽性率升高(分別達71.7%和80.2%)及P21表達上調(diào),但其IL-6的分泌量無顯著上升。本研究表明,MMC能誘導(dǎo)NIH-3T3和野生型MEF出現(xiàn)細胞衰老,但只有NIH-3T3細胞出現(xiàn)了典型的SASP現(xiàn)象。衰老NIH-3T3細胞可能是研究小鼠SASP的合適模型。
[Abstract]:Senescence related secretory phenotype (senescence-associated secretory phenotype,SASP) is a kind of hypersecretion associated with cell senescence. The factors secreted by senescence-associated secretory phenotype,SASP are involved in the process of cell senescence, immune regulation, angiogenesis, cell proliferation and tumor invasion and so on. Compared with human cells, the SASP model of mouse cells in vitro is still scarce, and the establishment of this model will facilitate the study of the pathogenesis and biological role of SASP. Therefore, the murine NIH-3T3 cell line (encoding p16INK4a protein) with INK4a locus deletion (encoding p16INK4a protein) and the wild-type mouse embryonic fibroblast (mouse embryonic fibroblasts,MEF) were used to induce DNA damage by mitomycin (C (mitomycin). Senescence related 尾 -galactosidase (尾 -gal) activity staining method was used to detect the integration rate of Ed U by Western blot, quantitative RT-PCR and ELISA, and to observe the senescence of cells and the expression and secretion level of SASP factor. The results showed that MMC (1 渭 g / mL) was treated for 12 h or 24 h, and then cultured for 8 days, the volume of NIH-3T3 cells became larger, the percentage of 尾 -gal staining positive (blue staining) cells increased significantly, reaching 77.4% and 90.4%, respectively, accompanied by the up-regulation of P21 protein expression and the decrease of Ed U integration rate (P0.01). At the same time, the expression level of m RNA in common SASP genes such as TNF- 偽 IL-1 偽 and IL-1 尾 was significantly up-regulated. Elisa assay showed that the secretion of IL-6 was also significantly increased (P0.01). On the contrary, although MMC treatment for 12 or 24 hours also induced the increase of cell volume, the positive rate of 尾 -gal staining (71.7% and 80.2%) and the up-regulation of P21 expression in wild-type MEF, the secretion of IL-6 did not increase significantly. The results showed that MMC could induce the senescence of NIH-3T3 and wild-type MEF cells, but only NIH-3T3 cells had typical SASP phenomenon. Aging NIH-3T3 cells may be a suitable model for the study of SASP in mice.
【作者單位】： 廣東醫(yī)科大學(xué)東莞科研中心衰老研究所;廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院;廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室;廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院;生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所;
【基金】：supported by grants from the Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province,China(No.A2012420) the Doctoral Initial Funding of Guangdong Provincial Medical University,China(No.B2011005) the Social Development Funding of Dongguan Municipality,Guangdong Province,China(No.2014108101047) the Special Funds for the Cultivation of Guangdong Provincial College Students’Scientific and Technological Innovation,China(No.pdjh2016b0216) the Innovation and Entrepreneurship Program for College Students of Guangdong Province,China(No.201410571018,201510571008,2014ZYDS017)
【分類號】：R339.38

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