【摘要】：目的：以Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type2, HSV-2) UL27、UL29為靶基因,構(gòu)建短發(fā)夾RNA (small hairpin RNA, shRNA)重組表達(dá)載體,在體外細(xì)胞水平上觀察HSV-2UL27, UL29單個(gè)靶向shRNA表達(dá)載體對(duì)病毒抑制的能力,以及聯(lián)合干擾兩個(gè)靶向shRNA表達(dá)載體對(duì)HSV-2復(fù)制的影響。 方法：針對(duì)HSV-2UL27、UL29基因各篩選出4條擬干擾靶位點(diǎn),分別構(gòu)建4組抑制UL27、UL29基因的短發(fā)夾RNA的真核表達(dá)載體,以及不針對(duì)任何序列的陰性表達(dá)載體shRNA NC。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,48小時(shí)后再接種HSV-2。篩選出具有干擾作用的shRNA,進(jìn)行聯(lián)合干擾。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)UL27各組、UL29各組及UL27+UL29組的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,終點(diǎn)滴定法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的各組病毒滴度,蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)效果。 結(jié)果：(1)酶切后電泳鑒定重組表達(dá)載體pGPU6/Neo-UL27、pGPU6/Neo-UL29和陰性表達(dá)載體shRNA NC;(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與空白組(未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體)比較,shRNA NC、UL27shRNA75組、UL27shRNA151組、UL27shRNA963組、UL27shRNA2265組抑制率分別為6.05%、75.17%、35.38%、30.74%、60.22%,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P0.05), shRNA NC與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；與空白組比較UL29shRNA897組、UL29shRNA939組、UL29shRNA1461組、UL29shRNA1653組抑制率分別為28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,均具有顯著性差異(P0.05),其中以UL29shRNA1461組效果為最佳。UL27shRNA75聯(lián)合UL29shRNA1461聯(lián)合干擾組抑制率達(dá)到91.28%,(與空白組比較)具有顯著性差異(P0.05)。(3)終點(diǎn)滴定法結(jié)果顯示UL27shRNA75組、UL27shRNA151組、UL27shRNA963組、UL27shRNA2265組、UL29shRNA897組、UL29shRNA1461組和UL27shRNA75與UL29shRNA1461聯(lián)合干擾組可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,與空白組比較差異性顯著(p0.01)。 結(jié)論：成功構(gòu)建pGPU6/Neo-UL27. pGPU6/Neo-UL29重組表達(dá)載體,shRNA能在體外細(xì)胞水平上不同程度的干擾HSV-2UL27、UL29基因表達(dá),UL27、UL29聯(lián)合干擾效率更高,抑制HSV-2在HEK293細(xì)胞中復(fù)制,為進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)抗HSV-2的研究提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Aim: to construct the recombinant expression vector of short hairpin RNA (small hairpin RNA, shRNA) with UL27,UL29 of herpes simplex virus type 鈪，

本文編號(hào)：2229368