【摘要】：臨18基因是C類Vps基因家族的一員,在進入溶酶體的膜泡運輸中發(fā)揮著重要作用。但是Vps18在哺乳動物中的生理功能目前尚無報道。應用基因打靶技術,我們在小鼠中剔除了Vps18基因。我們發(fā)現(xiàn)Vps18全身性基因剔除導致胚胎死亡或早期新生兒死亡。而神經(jīng)細胞特異性剔除小鼠,Vps18FI/FI; Nestin-Cre (Vps18CKO),呈現(xiàn)出明顯的生長遲緩,并且在出生后12天內(nèi)全部死亡。我們的研究發(fā)現(xiàn)Vps18CKO小鼠患嚴重的神經(jīng)退行性疾病。對其發(fā)病機制的研究揭示在Vps18缺陷的神經(jīng)細胞中,進入溶酶體的多條膜泡運輸途徑被阻斷,包括自噬途徑、內(nèi)吞途徑和溶酶體蛋白酶合成途徑。自噬泡、晚期內(nèi)吞泡和多層體在神經(jīng)細胞中大量積累,正是這些膜泡運輸途徑的紊亂導致了神經(jīng)細胞的凋亡。 我們的研究還發(fā)現(xiàn)Vps18缺陷阻礙神經(jīng)細胞遷移和浦肯野細胞樹突發(fā)育。進一步的研究顯示,Vps18CKO小鼠腦神經(jīng)細胞表面β1Integrin表達上調(diào),而通過RNAi的方法降低β1Integrin的表達可以部分回復Vps18CKO小鼠神經(jīng)細胞的遷移缺陷。研究還顯示Vps18缺失介導的小腦輻射狀膠質(zhì)細胞纖維結構異�？赡苁菍е耉ps18CKO鼠神經(jīng)細胞遷移缺陷的另一個原因。而Vps18缺失介導的Lox蛋白的累積則可能阻礙浦肯野細胞樹突發(fā)育。我們的研究揭示了Vps18基因在調(diào)控神經(jīng)細胞存活、遷移和樹突發(fā)育中的重要生理功能,為研究人類神經(jīng)退行性疾病的診斷和防治新策略提供了新的理論依據(jù)和思路。 癌癥是導致人類死亡的重要殺手之一。雖然在過去的幾十年里人們對癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機理進行了大量的研究,但是癌癥還遠遠沒有被攻克。在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)性的篩選腫瘤抑制基因,對于揭示癌癥的分子機理以及幫助我們開發(fā)和改進抗癌藥物至關重要。 逆轉(zhuǎn)錄病毒和轉(zhuǎn)座子是哺乳動物中常用的插入突變劑。人們常在這些插入突變劑中放入強啟動子,在小鼠體細胞中隨機過表達基因組中的內(nèi)源基因來篩選原癌基因。由于要在體細胞中利用插入突變同時破壞抑癌基因的兩個拷貝十分困難,到目前為止,這些插入突變劑還沒有能夠被用來篩選抑癌基因。piggyBac (PB)轉(zhuǎn)座子被證明是哺乳動物中效率最高的轉(zhuǎn)座子。我們制作了一個不具有強啟動子活性,但攜帶剪切受體和polyA轉(zhuǎn)錄終止信號的PB轉(zhuǎn)座子。這個PB轉(zhuǎn)座子能在基因組中阻斷基因表達但不能激活周圍基因表達。我們用這個PB轉(zhuǎn)座子建立了帶有高拷貝轉(zhuǎn)座子并且能高效轉(zhuǎn)座的PB轉(zhuǎn)基因小鼠。然后,我們將這個PB轉(zhuǎn)基因小鼠與MMTV-neu乳腺癌小鼠相結合用以在小鼠中篩選抑癌基因。我們初步的結果顯示不帶強啟動子的PB轉(zhuǎn)座子的插入突變雖然對MMTV-neu誘發(fā)的乳腺的發(fā)生和轉(zhuǎn)移沒有促進作用,但是卻能夠在小鼠中誘發(fā)心臟腫瘤。通過對腫瘤中PB插入位點的分析,我們定位了可能的抑癌基因Ctnna3,從而首次證明不具有強啟動子活性的PB插入突變可用以在小鼠體細胞中篩選抑癌基因。我們的研究為日后利用插入突變在小鼠中大規(guī)模篩選抑癌基因奠定了基礎。
[Abstract]:Lin18 gene is a member of class C Vps gene family and plays an important role in vesicular transport into lysosomes. However, the physiological function of Vps18 in mammals has not been reported yet. Using gene targeting technique, we deleted Vps18 gene from mice. We found that the deletion of Vps18 gene caused embryo death or early birth. Neuron-specific knockout mice, Vps18FI/FI; Nestin-Cre (Vps18CKO), showed marked growth retardation and all died within 12 days of birth. Our study found that Vps18CKO mice suffered from severe neurodegenerative diseases. Studies of the pathogenesis revealed that lysozyme was present in Vps18-deficient neurons. Autophagic vesicles, endocytosis and lysosomal protease biosynthesis pathways are blocked in many vesicle transport pathways. Autophagic vesicles, late endocytosis and multilayers accumulate in nerve cells. It is the disorder of these vesicle transport pathways that leads to apoptosis of nerve cells.
Our study also found that Vps18 deficiency inhibited neural cell migration and Purkinje cell tree burst growth. Further studies showed that the expression of beta-1 Integrin on the surface of Vps18CKO mouse brain neurons was up-regulated, and the reduction of beta-1 Integrin expression by RNAi could partly restore the migration deficiency of Vps18CKO mouse neurons. Vps18 deletion-mediated accumulation of Lox protein may inhibit the sudden development of Purkinje cell dendrites. Our study revealed that Vps18 gene regulates the survival, migration and dendritic burst of neural cells. The important physiological functions in childbearing provide new theoretical basis and ideas for the study of new strategies for the diagnosis and prevention of human neurodegenerative diseases.
Cancer is one of the most important killers of human death. Although a great deal of research has been done on the molecular mechanism of cancer development in the past few decades, cancer is still far from being conquered. It is very important to develop and improve anticancer drugs.
Retroviruses and transposons are insertion mutants commonly used in mammals. These insertion mutants are often inserted into strong promoters to randomly overexpress endogenous genes in the genome in mouse somatic cells to screen for proto-oncogenes. So far, these insertion mutants have not been used to screen tumor suppressor genes. PiggyBac (PB) transposon has proved to be the most efficient transposon in mammals. We have produced a PB transposon that does not have strong promoter activity but carries a shear receptor and a polyA transcription termination signal. We used this PB transposon to create PB transgenic mice with high-copy transposons and high-efficiency transposons. Then we combined the PB transgenic mice with MMTV-neu breast cancer mice to screen tumor suppressor genes in mice. The insertion mutation of PB transposon without strong promoter could induce cardiac tumors in mice, although it did not promote the occurrence and metastasis of breast induced by MMTV-neu. By analyzing the insertion site of PB in tumors, we located the possible tumor suppressor gene Ctnna3, which proved for the first time that P had no strong promoter activity. B insertion mutation can be used to screen tumor suppressor genes in mouse somatic cells.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R339.35

【共引文獻】

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本文編號：2220751