【摘要】：建立一種以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)為基礎(chǔ)來(lái)檢測(cè)人ABO天然血型特異性抗體的新技術(shù)。使用商品來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)化人源紅細(xì)胞作為統(tǒng)一反應(yīng)的靶細(xì)胞,與相對(duì)應(yīng)的健康人血清樣本作用后再加入特異性熒光標(biāo)記的二抗,采用FCM檢測(cè)特異性血型抗體滴度水平。通過(guò)檢測(cè)所收集的52例健康人血清樣本并對(duì)比以傳統(tǒng)血液凝集法改進(jìn)的酶標(biāo)儀法,綜合比較分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果顯示：血型抗體(IgM為主)水平的變化趨勢(shì)上兩種方法關(guān)聯(lián)性較好,但FCM新方法顯示出更好的特異性、靈敏性和重復(fù)性,并能夠半定量抗體及其分型(IgM、IgG及亞型)。FCM法是一種更為精確的天然血型抗體檢測(cè)技術(shù),將來(lái)很可能逐步替代傳統(tǒng)的血液凝集法應(yīng)用于ABO血型不合移植的血型抗體定量化及用于手術(shù)監(jiān)測(cè)的全過(guò)程。 絕大部分靈長(zhǎng)類動(dòng)物存在與人類相似的ABO血型系統(tǒng),本部分的研究采用改良FCM法檢測(cè)獼猴及食蟹猴血清中血型抗體水平及抗體的分布情況。同上一部分所述相同,以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ),預(yù)先用人O型濃縮紅細(xì)胞吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體采用商品化來(lái)源的人源紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞統(tǒng)一抗原的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量,并通過(guò)加入特異性熒光標(biāo)記的抗人IgM或IgG二抗,對(duì)收集的實(shí)驗(yàn)用獼猴及食蟹猴的血清樣本預(yù)先用人O型濃縮紅細(xì)胞吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體,然后再進(jìn)行檢測(cè),以健康受試者的血清樣本為對(duì)照,比較二者血型抗體水平的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)預(yù)先處理吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體的改良步驟后,FCM法同樣能夠準(zhǔn)確檢測(cè)猴的血型抗體水平及分型。結(jié)果顯示猴血清中天然血型抗體以IgM為主,滴度水平明顯低于健康人(P0.05)。由此我們得出改良后的FCM法同樣適用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清中血型抗體水平的檢測(cè),這為構(gòu)建靈長(zhǎng)類動(dòng)物模擬人ABO血型不合器官移植模型的成功建立提供了關(guān)鍵技術(shù)保障。 本部分采用鑰孔戚血藍(lán)蛋白耦聯(lián)ABO血型抗原A特異表位(N一乙酰氨基半乳糖)(KLH-A)體內(nèi)預(yù)致敏的方法,成功提高了食蟹猴(B血型)循環(huán)內(nèi)的抗A血型抗體的水平。使用前述改良FCM法檢測(cè)猴致敏前后血型抗體IgM和IgG水平的變化,并對(duì)比其差異。結(jié)果顯示通過(guò)KLH-A成功致敏后顯著升高食蟹猴血型抗體IgM水平,同時(shí)非血型預(yù)存抗體IgG的表達(dá)也有升高(P0.001),致敏效果及升高后抗體水平的維持時(shí)間都存在一定的個(gè)體化差異。由此可得出通過(guò)KLH- A或B的預(yù)致敏不但能夠特異刺激猴循環(huán)中針對(duì)血型抗原的抗體IgM的高表達(dá),也提高了非特異抗體IgG的水平。通過(guò)預(yù)致敏后成功的升高了靈長(zhǎng)類大動(dòng)物的血型抗體水平,這也為模擬臨床ABO血型不合腎移植模型的成功建立提供了良好的實(shí)驗(yàn)前提。 該部分我們成功建立了預(yù)致敏后施行同種異體ABO血型不合的腎移植術(shù),并由血型抗體介導(dǎo)激活補(bǔ)體殺傷最終導(dǎo)致的超急性排斥反應(yīng)的模型。應(yīng)用改良FCM法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)食蟹猴體內(nèi)手術(shù)前預(yù)存天然ABO血型抗體滴度,結(jié)果顯示血型抗體水平較低的對(duì)照猴,直接施行ABO血型不合的同種異體腎移植無(wú)法導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)的免疫結(jié)果。病理研究顯示對(duì)照組移植腎臟并未顯示超急性排斥反應(yīng)的證據(jù),而是顯示急性體液性和細(xì)胞性排斥混合的病理特征,免疫組化也未見血型抗體(IgM或IgG)及補(bǔ)體片段(C4d及C5b-9)的沉積。而在KLH-A預(yù)致敏的實(shí)驗(yàn)組(n=2),受體猴(血型B)接受KLH-A預(yù)致敏14天后,再接受來(lái)自供體猴(血型A)的腎臟移植,結(jié)果2只受體猴的移植腎均在血管吻合開放血流后1小時(shí)內(nèi)由鮮紅色變?yōu)楹谧仙?其中一例(07cy05)于開放血流一小時(shí)內(nèi)切取移植腎標(biāo)本,另一例(09cy15)于術(shù)后第二日切取移植腎標(biāo)本,病理和免疫組化的結(jié)果均顯示明確的超急性排斥的。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)組受體猴施行腎移植術(shù)后的發(fā)生超急性排斥的移植腎的病理學(xué)特點(diǎn)及免疫學(xué)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究分析,進(jìn)一步為模擬臨床ABO血型不合腎移植術(shù)后的排斥診療和預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:A new technique based on flow cytometry (FCM) was developed for the detection of ABO natural blood group specific antibodies. Standardized human red blood cells from commercial origin were used as the target cells for the unified reaction, and the corresponding healthy human serum samples were treated with specific fluorescent labeled antibodies, and the specific blood group antibody droplets were detected by FCM. The results of the two methods showed that there was a good correlation between the two methods, but the new FCM method showed better specificity, sensitivity and sensitivity. FCM is a more accurate technique for detecting natural blood group antibodies. It is likely that FCM will gradually replace traditional blood agglutination methods in the quantitative analysis of ABO blood group incompatible blood group antibodies and the whole process of operation monitoring.
Most of the primates have ABO blood group systems similar to those of humans. In this part, the serum antibody levels and antibody distribution in rhesus monkeys and cynomolgus monkeys were detected by modified FCM. As mentioned in the previous part, the blood group antibody levels and antibody distribution in monkey serum were determined by flow cytometry. The non-specific antibodies were expressed by commercial human red blood cells as the standard antigens of the target cells. The serum samples of experimental rhesus monkeys and cynomolgus monkeys were pre-adsorbed with human O-type concentrated red blood cells to adsorb the non-specific antibodies contained in monkey serum by adding specific fluorescent labeled anti-human IgM or IgG antibodies. The results showed that the FCM method could also accurately detect the levels and types of blood group antibodies in monkeys after the modified procedure of adsorbing non-specific antibodies in monkey serum. The antibody titer of natural blood group in Qingzhong was significantly lower than that in healthy people (P
In this part, the levels of anti-A blood group antibodies in the circulatory system of cynomolgus monkeys (B blood group) were successfully increased by pre-sensitization with the key-hole hemocyanin-coupled ABO blood group antigen A specific epitope (N-acetylgalactosamine) (KLH-A). The changes of IgM and IgG levels of blood group antibodies in monkeys before and after sensitization were detected by the modified FCM method. The results showed that the blood group antibody IgM level and the expression of non-blood group antibody IgG were significantly increased in cynomolgus monkeys sensitized by KLH-A (P 0.001). The sensitization effect and the duration of antibody level after sensitization were individualized. The high expression of antibody IgM against blood group antigen in monkey circulation also increased the level of non-specific antibody IgG. The blood group antibody level of primates was successfully increased after pre-sensitization, which provided a good experimental premise for the successful establishment of a clinical ABO incompatible kidney transplantation model.
In this part, we successfully established a model of hyperacute rejection induced by allogeneic ABO-incompatible kidney transplantation after pre-sensitization and activated complement killing mediated by blood group antibody. The antibody titer of natural ABO blood group pre-stored in experimental cynomolgus monkeys was detected by modified FCM method. The results showed that the antibody level of blood group was high. In the lower control group, ABO incompatible allograft kidney transplantation did not lead to hyperacute rejection. Pathological studies showed no evidence of hyperacute rejection in the control group, but showed mixed pathological features of acute humoral and cellular rejection, and no blood group antibody was found in immunohistochemistry. Deposition of body (IgM or IgG) and complement fragments (C4d and C5b-9). In the KLH-A pre-sensitized group (n=2), recipient monkeys (blood group B) received KLH-A pre-sensitized kidney transplantation 14 days later, and then received kidney transplantation from donor monkeys (blood group A). Results The transplanted kidneys of both recipient monkeys changed from bright red to black-purple within 1 hour after blood flow anastomosis. The pathological and immunohistochemical results of one case (07cy05) and the other (09cy15) showed definite hyperacute rejection on the second day after renal transplantation. We studied the pathological and immunological characteristics of hyperacute rejection in the recipient monkeys of the experimental group. The changes were systematically analyzed to provide experimental evidence for the treatment and prevention of rejection after simulated clinical ABO incompatible renal transplantation.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R-332

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本文編號(hào)：2211129