【摘要】：雌激素作為類固醇激素,主要通過和細胞核(膜)上的雌激素受體結合,在人體的靶器官和組織中發(fā)揮重要的調控作用,可影響分泌、新陳代謝以及生殖和發(fā)育等正常的生理功能。 機體內雌激素的水平由合成和代謝途徑來達到平衡。雌激素的合成由芳香酶、17β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ(17β-HSD1)和硫酸酯酶(STS)參與；而雌激素的代謝則主要通過硫酸化途徑完成,可將雌激素轉化為硫酸化的雌激素。其中,雌激素硫酸轉移酶SULT1E1是雌激素硫酸化反應的關鍵酶。目前,關于雌激素硫酸轉移酶SULT1E1的研究多集中在它和激素依賴性腫瘤之間的關系,具體調節(jié)機制尚不十分清楚；另外,SULT1E1在雌激素的另一個靶組織——血管內皮中的功能尚未見研究報道。因此,本課題分三個部分,分別研究雌激素硫酸轉移酶SULT1E1在激素依賴性腫瘤以及血管內皮細胞中的功能及調控： 第一部分：雌激素可通過調節(jié)細胞增殖和凋亡影響激素依賴性腫瘤包括乳腺癌和子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展。硫酸化反應是雌激素代謝的主要途徑,雌激素硫酸轉移酶SULT1E1是該反應的關鍵酶,PAPSS(包括PAPSS1和PAPSS2)則提供反應底物硫酸基團。首先,通過組織芯片染色以及臨床病理標本分析,我們發(fā)現(xiàn)雌激素硫酸轉移酶SULT1E1和PAPSS在腫瘤及其癌旁(正常)組織中的表達存在差異性,SULT1E1和PAPSS在腫瘤組織的表達較正�；蛘甙┡越M織高。體內實驗發(fā)現(xiàn)注射腺病毒SULT1E1可以抑制裸鼠移植瘤的生長。在MCF-7細胞體外過表達SULT1E1和PAPSS1后,細胞增殖實驗結果顯示,過表達SULT1E1和PAPSS1可以抑制雌激素引起的細胞增殖；流式細胞檢測表明：雌激素可以保護H202誘導的MCF-7細胞凋亡,而SULT1E1和PAPSS1可通過硫酸化雌激素來加速細胞的凋亡。為進一步闡明其發(fā)生機制,我們檢測了增殖和凋亡相關的基因／蛋白的表達水平。結果發(fā)現(xiàn),過表達SULT1E1和PAPSS1可下調癌基因c-myc,細胞周期蛋白cyclin Dl以及抗凋亡分子bcl-2的表達,而上調促凋亡分子bax的水平。說明SULT1E1和PAPSS1通過調節(jié)細胞增殖和凋亡相關分子的水平抑制腫瘤細胞增殖,促進細胞凋亡。 第二部分：雌激素在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用,可保護血管內皮細胞的功能。雌激素可被硫酸轉移酶SULT1E1催化生成硫酸化雌激素。但迄今為止,尚未見有關SULT1E1在內皮細胞中的功能的研究報道。我們推測,SULT1E1可能影響內皮細胞的功能。我們檢測了SULT1E1在臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中的表達,結果顯示：SULT1E1在HUVEC中表達較豐富且在前幾代細胞中持續(xù)表達。因此,我們設計合成了針對SULT1E1的siRNA干擾片段。干擾SULT1E1之后可以下調SULT1E1的表達,減弱酶的活性以及降低雌激素硫酸化水平。體內酶活性檢測表明：SULT1E1可轉化80nM的雌激素,而干擾SULT1E1只能轉化40nM的雌激素。通過實時PCR基因篩選,我們發(fā)現(xiàn)干擾SULT1E1后可調節(jié)炎癥因子的釋放、膽固醇水平以及細胞遷移,并影響其相關基因和蛋白的表達。而干擾PPARγ或者加入PPARγ抑制劑GW9662可拮抗SULT1E1的調節(jié)作用。為,我們進一步探討了雌激素是否會影響SULT1E1的作用。和不加雌激素相比,加入80nM的雌激素可以逆轉SULT1E1對炎癥因子、脂質代謝和細胞遷移相關分子的調節(jié)作用,而雌激素受體ERp干擾或者雌激素受體ER拮抗劑IC1182780處理后,雌激素的調節(jié)作用減弱。為解釋這一現(xiàn)象,我們加入雌激素E2和硫酸化雌激素E2S檢測它們對上述基因的調節(jié)。E2S可以上調PPARγ、IL-4和脂質代謝相關基因的表達,E2作用剛好相反。這說明,在外源性雌激素存在的情況下,對照組只有E2S的調節(jié)作用,而干擾SULT1E1組有E2和E2S的雙重調節(jié)。該結果表明,干擾SULT1E1影響了E2和E2S的比例,進而調節(jié)PPARγ影響HUVEC的炎癥因子釋放、膽固醇代謝和細胞遷移能力。 第三部分：基于雌激素硫酸轉移酶SULT1E1在雌激素功能中的影響的重要性,針對SULT1E1的調控顯得尤為重要。目前,關于SULT1E1的調節(jié)方面的研究不多。有文獻報道,IGF-1可以增加乳腺癌細胞中雌激素硫酸酯酶STS的活性；另外,PPARα對硫酸轉移酶的調節(jié)尚存在爭議。因此,我們推測IGF-1和PPARα可能調節(jié)SULT1E1的表達。我們檢測了HUVEC和HUASMC中SULT1E1的表達,結果顯示SULT1E1在這兩種細胞中均有表達。加入IGF-1后,SULT1E1的表達上調；而加入PPARa激動劑WY14643后,SULT1E1的表達下調。通過體內SULT1E1酶活性檢測發(fā)現(xiàn),在HUASMC細胞中,IGF-1增強SULT1E1酶的活性使硫酸化雌激素的生成增加；WY14643減弱SULT1E1酶的活性而減少了硫酸化雌激素的生成。我們構建含SULT1E1啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因載體。通過熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn),IGF-1使SULT1E1的熒光素酶活性增加；而加入PPARα激動劑WY14643后,SULT1E1的熒光素酶活性下降。 綜上所述,我們得出以下結論：雌激素硫酸轉移酶SULT1E1和PAPSS可通過調節(jié)細胞增殖和凋亡來減慢裸鼠移植瘤的生長并且抑制雌激素誘導的腫瘤細胞促增殖和抗凋亡作用；另外,SULT1E1可通過調節(jié)PPARγ影響臍靜脈內皮細胞的炎癥因子分泌、膽固醇代謝以及細胞遷移。胰島素樣生長因子IGF-1和PPARα激動劑WY14643可通過轉錄水平調節(jié)SULT1E1的表達，，并可影響SULT1E1酶的活性。該研究為雌激素硫酸轉移酶SULT1E1對雌激素功能的影響提供了新的研究思路。
[Abstract]:Estrogen, as a steroid hormone, plays an important regulatory role in the target organs and tissues of the human body by binding to estrogen receptors in the nucleus (membrane), which can affect the secretion, metabolism, reproduction and development of normal physiological functions.
Estrogen synthesis is mediated by aromatase, 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase I (17beta-HSD1) and sulfatase (STS). Estrogen metabolism is mainly accomplished by sulfation, which converts estrogen into sulfated estrogen. SULT1E1 is a key enzyme in the sulfation of estrogen. At present, the research on the relationship between SULT1E1 and hormone-dependent tumors is mostly focused on, and the specific regulatory mechanism is still unclear. In addition, the function of SULT1E1 in the vascular endothelium, another target tissue of estrogen, has not been reported. Therefore, this study is divided into three parts, respectively, to study the function and regulation of estrogen sulfate transferase SULT1E1 in hormone-dependent tumors and vascular endothelial cells.
Part I: Estrogen affects the development of hormone-dependent tumors, including breast and endometrial cancers, by regulating cell proliferation and apoptosis. Sulfation is the main pathway of estrogen metabolism. Estrogen sulfate transferase SULT1E1 is the key enzyme in this reaction, and PAPSS (including PAPSS1 and PAPS2) provides the substrate sulfate. Firstly, through tissue chip staining and clinicopathological analysis, we found that the expression of estrogen sulfate transferase SULT1E1 and PAPSS was different in tumor and adjacent (normal) tissues. The expression of SULT1E1 and PAPSS in tumor tissues was higher than that in normal or adjacent tissues. The proliferation of MCF-7 cells overexpressing SULT1E1 and PAPS1 in vitro showed that the overexpression of SULT1E1 and PAPS1 could inhibit the proliferation of MCF-7 cells induced by estrogen. Flow cytometry showed that estrogen could protect the apoptosis of MCF-7 cells induced by H202, while SULT1E1 and PAPS1 could sulfate the female. To further elucidate the mechanism of apoptosis, we examined the expression of genes/proteins associated with proliferation and apoptosis. Overexpression of SULT1E1 and PAPS1 down-regulated the expression of oncogene c-myc, cyclin Dl and anti-apoptotic molecule bcl-2, and up-regulated the expression of apoptotic molecule bax. These results suggest that SULT1E1 and PAPS1 can inhibit the proliferation of tumor cells and promote apoptosis by regulating the levels of cell proliferation and apoptosis-related molecules.
Part II: Estrogen plays an important role in the cardiovascular system and protects the function of vascular endothelial cells. Estrogen can be catalyzed by sulfate transferase SULT1E1 to produce sulfated estrogen. However, so far, there are no reports about the function of SULT1E1 in endothelial cells. We speculate that SULT1E1 may affect endothelial cells. Function. We examined the expression of SULT1E1 in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The results showed that SULT1E1 was abundantly expressed in HUVEC and was continuously expressed in previous generations of cells. Therefore, we designed and synthesized siRNA interference fragments targeting SULT1E1. Estrogen sulfation level.In vivo enzyme activity assay showed that SULT1E1 could transform 80 nM estrogen, while interfering with SULT1E1 could only transform 40 nM estrogen.Through real-time PCR gene screening, we found that interfering with SULT1E1 could regulate the release of inflammatory factors, cholesterol levels and cell migration, and affect the expression of related genes and proteins. In order to further explore whether estrogen affects the function of SULT1E1, estrogen can reverse the regulation of SULT1E1 on inflammatory factors, lipid metabolism and cell migration-related molecules, while estrogen can reverse the regulation of SULT1E1 on inflammatory factors, lipid metabolism and cell migration-related molecules without estrogen. In order to explain this phenomenon, we added estrogen E2 and sulfated estrogen E2S to detect their regulation of the above genes. E2S could up-regulate the expression of PPAR-gamma, IL-4 and lipid metabolism-related genes, and E2 had the opposite effect. In the presence of exogenous estrogen, only E2S could be regulated in the control group, while E2 and E2S could be regulated in the SULT1E1 group by interfering with SULT1E1.
Part III: Based on the importance of the role of estrogen sulfate transferase SULT1E1 in estrogen function, the regulation of SULT1E1 is particularly important. At present, there are few studies on the regulation of SULT1E1. The expression of SULT1E1 in HUVEC and HUASMC was detected. The expression of SULT1E1 was up-regulated after the addition of IGF-1, and down-regulated after the addition of PPARa agonist WY14643. In vivo SULT1E1 enzyme activity assay showed that in HUASMC cells, IGF-1 enhanced the activity of SULT1E1 enzyme and increased the production of sulfated estrogen; WY14643 decreased the activity of SULT1E1 enzyme and decreased the production of sulfated estrogen. We constructed a luciferase reporter gene vector containing the promoter region of SULT1E1. IGF-1 increased the luciferase activity of SULT1E1, while the luciferase activity of SULT1E1 decreased when PPARa agonist WY14643 was added.
In conclusion, we conclude that estrogen sulfate transferase SULT1E1 and PAPSS can slow down the growth of xenografts in nude mice by regulating cell proliferation and apoptosis and inhibit estrogen-induced proliferation and Anti-apoptosis of tumor cells. In addition, SULT1E1 can affect the inflammatory factors of umbilical vein endothelial cells by regulating PPAR gamma. Insulin-like growth factor-1 and PPAR alpha agonist WY14643 can regulate the expression of SULT1E1 at transcriptional level and affect the activity of SULT1E1 enzyme. This study provides a new research idea for the effect of estrogen sulfate transferase SULT1E1 on estrogen function.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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