【摘要】：第一部分應(yīng)用AdMax載體系統(tǒng)構(gòu)建CXCR4-siRNA重組腺病毒載體 目的：應(yīng)用AdMax載體系統(tǒng)構(gòu)建CXCR4-siRNA重組腺病毒載體，為研究其對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的CXCR4基因表達(dá)的影響奠定基礎(chǔ)。 方法：將CXCR4基因的小干擾片段克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒PAVsi1.1，通過(guò)PCR和測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，將重組穿梭質(zhì)粒、腺病毒輔助包裝質(zhì)粒、3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生CXCR4-siRNA重組腺病毒載體。在HEK293細(xì)胞中大量包裝擴(kuò)增病毒，收集病毒液，測(cè)定病毒滴度。 結(jié)果：PCR和測(cè)序結(jié)果均提示CXCR4基因的小干擾片段成功構(gòu)建至腺病毒穿梭質(zhì)粒，通過(guò)HEK293反復(fù)包裝擴(kuò)增后，在熒光顯微鏡下可觀察到HEK293細(xì)胞中綠色熒光蛋白的大量表達(dá)，病毒滴度為6×108PFU/ml。 結(jié)論：AdMax載體系統(tǒng)可成功構(gòu)建CXCR4-siRNA重組腺病毒載體。 第二部分CXCR4-siRNA重組腺病毒載體沉默人卵巢癌細(xì)胞株CXCR4基因表達(dá)的研究 目的：研究CXCR4-siRNA重組腺病毒載體對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的CXCR4基因表達(dá)的影響。 方法：將收集的大量病毒液轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3。細(xì)胞分為三組：siRNA組，轉(zhuǎn)染空病毒載體的陰性對(duì)照組，，細(xì)胞不做任何處理的空白對(duì)照組。通過(guò)PCR、Western blot、免疫組化檢測(cè)CXCR4基因沉默效果。 結(jié)果：病毒轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到SKOV3細(xì)胞中綠色熒光蛋白的大量表達(dá)，重組腺病毒能夠有效抑制SKOV3細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)。 結(jié)論：CXCR4-siRNA重組腺病毒載體可高效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞和沉默CXCR4基因的表達(dá)，為RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌的臨床基因治療奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The first part was to construct the recombinant adenovirus vector of CXCR4-siRNA by using AdMax vector system. Objective: to construct the recombinant adenovirus vector of CXCR4-siRNA by using AdMax vector system, and to study the effect of the recombinant adenovirus vector on the expression of CXCR4 gene in human ovarian cancer cell line SKOV3. Methods: the small interfering fragment of CXCR4 gene was cloned into the adenovirus shuttle plasmid PAVsi1.1.The recombinant shuttle plasmid was screened by PCR and sequenced. The recombinant shuttle plasmid and adenovirus-assisted packaging plasmid were co-transfected into HEK293 cells to produce CXCR4-siRNA recombinant adenovirus vector. The virus was packed and amplified in HEK293 cells, the virus solution was collected and the titer of the virus was measured. Results the small interfering fragment of CXCR4 gene was successfully constructed into adenovirus shuttle plasmid. After repeated HEK293 packaging and amplification, a large amount of green fluorescent protein expression in HEK293 cells was observed under fluorescence microscope. The titer of the virus was 6 脳 108 PFU / ml. Conclusion the CXCR4-siRNA recombinant adenovirus vector can be constructed successfully by using the CXCR4-siRNA vector system. The second part of the study on the silencing of CXCR4 gene expression in human ovarian cancer cell line by CXCR4-siRNA recombinant adenovirus vector objective: to study the effect of CXCR4-siRNA recombinant adenovirus vector on the expression of CXCR4 gene in human ovarian cancer cell line SKOV3. Methods: a large number of viral fluids were transfected into human ovarian cancer cell line SKOV3. The cells were divided into three groups: the negative control group transfected with empty virus vector and the blank control group without any treatment. The silencing effect of CXCR4 gene was detected by immunohistochemistry. Results: after the virus was transfected into SKOV3 cells, a large amount of green fluorescent protein expression in SKOV3 cells was observed under fluorescence microscope, and the recombinant adenovirus could effectively inhibit the expression of CXCR4 in SKOV3 cells. Conclusion the recombinant adenovirus vector of CXCR4-siRNA can efficiently transfect target cells and silence the expression of CXCR4 gene, which lays a foundation for the application of RNA interference technique in clinical gene therapy of ovarian cancer.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2198220