【摘要】：研究目的： 該課題在本實驗室前期研究基礎(chǔ)上,進一步探討RhoA-ROCK介導(dǎo)的人膜突蛋白(moesin)磷酸化對晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)引起的內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能改變的調(diào)節(jié)作用。在前期研究中已經(jīng)證明了：1.AGEs通過誘導(dǎo)moesin磷酸化,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的改變,進而引起血管通透性增高。2.Rho激酶(Rho kinase, ROCK)參與了AGEs引起的內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的改變。因此本課題欲進一步解決以下問題：1.驗證Rho/ROCK信號通路是否通過介導(dǎo)moesin的磷酸化,參與AGEs引起的內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的調(diào)節(jié)。2.進一步探討Rho/ROCK信號通路引起Inoesin磷酸化的方式,是否通過直接與moesin作用導(dǎo)致其磷酸化。3.進一步查明AGE/ROCK介導(dǎo)下moesin第558位蘇氨酸殘基(moesinT558)磷酸化在內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能改變中的作用,為改善該病理過程提供切入點。 本課題選用RhoA顯性負效突變體(RhoAN19)和組成型活性突變體(RhoA L63)的重組腺病毒感染細胞,應(yīng)用G-LISA試劑盒檢測法檢測RhoA活性和免疫印跡技術(shù)檢測ROCK的磷酸化,并結(jié)合本實驗室前期研究使用ROCK抑制劑處理細胞所得結(jié)果,進一步明確Rho/ROCK通路是否參與了AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞形態(tài)及功能的改變；通過免疫共沉淀技術(shù)檢測ROCK與moesin的相互作用,查明ROCK是否通過直接與moesin結(jié)合導(dǎo)致其磷酸化。通過分子克隆及體外定點突變技術(shù)分別構(gòu)建moesin的真核表達質(zhì)粒pcDNA3/HA-moesin及其抑制型突變體pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突變體pcDNA3/HA-moesinT558D,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細胞,經(jīng)實時熒光定量PCR、免疫印跡、單層內(nèi)皮細胞通透性的測定及內(nèi)皮細胞骨架纖維狀肌動蛋白(filamentous actin, F-actin)形態(tài)和定位的檢測,并結(jié)合本實驗室前期研究結(jié)果,進一步查明在AGEs誘導(dǎo)下moesin的具體磷酸化位點。本研究通過進一步明確RhoA/ROCK通路在AGEs導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞功能變化中的作用,查明ROCK介導(dǎo)moesin磷酸化的方式和moesinT558位點的功能,探討AGEs引起的內(nèi)皮細胞功能變化的分子機制,有助于闡明糖尿病性微血管病變發(fā)生發(fā)展的機制,并為其治療提供新的思路。 方法： AGE-HSA由人血清白蛋白與D-葡萄糖共孵育8周并過濾透析制得。體外培養(yǎng)人皮膚微血管內(nèi)皮細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞株,分別接種于微孔小皿(petri dish)、雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell)頂層小室微孔膜上(直徑6.5mm,孔徑大小0.4μm)、6 cm和10cm細胞培養(yǎng)皿上,待細胞長至融合或接近融合時,換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細胞獲得同步生長,然后按實驗分組分別處理備用。選用RhoA顯性負效突變體(RhoAN19)和組成型活性突變體(RhoAL63)的重組腺病毒感染細胞,應(yīng)用G-LISA試劑盒檢測法檢測RhoA活性和免疫印跡技術(shù)檢測ROCK的磷酸化；經(jīng)免疫共沉淀技術(shù)檢測ROCK與]moesin的相互作用；經(jīng)分子克隆及體外定點突變技術(shù)分別構(gòu)建moesin磷酸化位點突變的真核表達質(zhì)粒,抑制型突變體pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突變體pcDNA3/HA-moesinT558D分別以丙氨酸和天冬氨酸替代蘇氨酸獲得,經(jīng)脂質(zhì)體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞24 h,繼以AGE-HSA 50 mg/L孵育。用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架肌動蛋白F-actin形態(tài)及分布改變；用免疫印跡技術(shù)檢測]moesin的磷酸化,采用多功能蛋白組學(xué)影像系統(tǒng)KODAK2000R直接成像,以Image J欽件分析各組灰度值,P-actin為內(nèi)參進行校正,以對照組面積灰度值為100%與實驗組進行比較；用TRITC熒光標(biāo)記蛋白漏出法測定單層內(nèi)皮細胞的通透系數(shù)Pa值,實驗結(jié)果以Pa變化百分比表示,Pa%=(實驗樣品Pa值/對照樣品Pa值)×100。 結(jié)果： 1.AGE-HSA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞RhoA活性增高 (1) AGE-HSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞RhoA活性增高 給予AGE-HSA刺激引起RhoA活性顯著增加,且呈時間(F=14.169,P=0.000)和劑量(F=8.405,P=0.000)依賴性。在時間效應(yīng)組中,隨著AGE-HSA作用時間的延長,細胞中RhoA活性逐漸增高,與對照組相比,從30min分鐘起差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002),至60min時,到達峰值,隨后RhoA活性開始緩慢下降,當(dāng)AGE-HSA作用120min時與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。劑量效應(yīng)組中,隨著AGE-HSA濃度的增加,內(nèi)皮細胞細胞中RhoA活性逐漸增多,當(dāng)AGE-HSA濃度達到25mg/L時,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008),隨著AGE-HSA濃度增加,RhoA活性持續(xù)增加,當(dāng)達到50 mg/L時,RhoA活性達到峰值(P=0.000),當(dāng)達到100mg/L時,RhoA活性開始下降,但與對照相比,仍有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。結(jié)果提示：AGE-HSA能引起內(nèi)皮細胞RhoA活性的增高,并呈時間和劑量依賴性。 (2)L63和N19重組腺病毒對AGE-HSA介導(dǎo)的RhoA活性變化的影響 與對照組相比,給予AGE-HSA刺激后,RhoA活性明顯增高(P=0.000),轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoAL63)后,RhoA活性也明顯增高(P=0.000),轉(zhuǎn)染RhoA顯性負效突變體(RhoA N19)后可下調(diào)RhoA的活性(P=0.000),而先轉(zhuǎn)染顯性負效突變體(RhoAN19) 24 h后,然后再和AGE-HSA作用,則明顯抑制了AGE-HSA引起的RhoA活性增高(P=0.000)。 (3)L63和N19重組腺病毒對AGE-HSA介導(dǎo)的ROCK磷酸化的影響 與對照組相比,給予AGE-HSA刺激ROCK磷酸化水平明顯增高(P=0.001),轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoAL63)后ROCK磷酸化水平也明顯增高(P=0.001),而先轉(zhuǎn)染RhoA顯性負效突變體24h后,再給予AGE-HSA 50 mg/L刺激1h后,ROCK磷酸化水平較AGE-HSA組下降(P=0.019)。結(jié)果提示：AGE-HSA通過激活RhoA導(dǎo)致ROCK磷酸化,下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的ROCK磷酸化。 (4)L63和N19重組腺病毒對AGE-HSA介導(dǎo)的,moesin磷酸化的影響 給予AGE-HSA刺激及轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoAL63)后,moesin磷酸化水平明顯增高(P=0.000),先轉(zhuǎn)染RhoA顯性負效突變體(RhoA N19) 24 h后,再給予AGE-HSA 50 mg/L刺激1h后,moesin磷酸化水平較AGE組下降(P=0.001),提示下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE誘導(dǎo)的moesin磷酸化。結(jié)果提示：下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的moesin磷酸化。 2.內(nèi)皮細胞內(nèi)源性ROCK與moesin的相互作用 提取內(nèi)皮細胞總蛋白后,以moesin特異性抗體免疫沉淀后,再以ROCK特異性抗體做免疫印跡檢測,結(jié)果在有或無AGE-HSA刺激的條件下,均可檢測到ROCK,分子量大小與陽性對照組相同,而陰性對照組未檢測到。再以ROCK特異性抗體免疫沉淀后,以moesin特異性抗體做免疫印跡檢測,結(jié)果同樣在有或無AGE-HSA刺激的條件下,均可檢測到moesin。提示在正常情況下細胞內(nèi)源性ROCK與moesin存在于一個復(fù)合體中,因此本研究進一步檢測了p-ROCK與moesin的相互作用,以p-ROCK特異性抗體免疫沉淀后,再以moesin特異性抗體做免疫印跡檢測,結(jié)果顯示在給予AGE-HSA刺激后,moesin的條帶與無AGE-HSA刺激時明顯減少。我們推測moesin與p-ROCK的結(jié)合減少,可能是moesin被磷酸化激活后脫離復(fù)合體而履行其連接蛋白的功能。 3.成功構(gòu)建moesin磷酸化位點突變質(zhì)粒并在內(nèi)皮細胞中表達 經(jīng)分子克隆及體外定點突變技術(shù)構(gòu)建moesin磷酸化位點突變的真核表達質(zhì)粒,抑制型突變體pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突變體pcDNA3/HA-moesinT558D分別以丙氨酸和天冬氨酸替代蘇氨酸獲得。經(jīng)脂質(zhì)體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞24h,分別提取細胞總RNA和總蛋白,實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-moesinT558A的內(nèi)皮細胞moesin mRNA表達與對照組相比明顯增高(P=0.001),轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-moesinT558D的moesin mRNA表達與對照組相比也明顯增高(P=0.000),免疫印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-moesinT558A和pcDNA3/HA-moesinT558D的內(nèi)皮細胞均可檢測到HA-moesin的表達,而未轉(zhuǎn)染組未檢測到。結(jié)果提示：構(gòu)建了moesin磷酸化位點突變質(zhì)粒,并在內(nèi)皮細胞中成功表達。 4.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinTS58D質(zhì)粒對AGE-HSA介導(dǎo)的moesin磷酸化的影響 與對照組相比,單獨給予AGE-HSA刺激(P=0.001)或單獨轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D (P=0.002), moesin磷酸化水平均升高。而轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesinT558A后,再給予AGE-HSA 50 mg/L刺激1 h,moesin磷酸化水平較單獨給予AGE-HSA刺激組相比明顯下降(P=0.015)(圖16)。結(jié)果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的moesin磷酸化,而pcDNA3-HA-moesinT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的moesin磷酸化。 5.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對AGE-HSA介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞通透性改變及細胞骨架肌動蛋白F-actin形態(tài)及分布變化的影響 (1)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對AGE-HSA介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞通透性改變的影響 單獨給予AGE-HSA刺激內(nèi)皮細胞通透性較正常對照組明顯增高(P=0.000),單獨轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D后,內(nèi)皮細胞通透性較正常對照組組也明顯增高(P=0.000),而預(yù)先轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesinT558A,后給予AGE-HSA刺激,能夠顯著抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞高通透性(P=0.000),但仍未達到正常水平。而預(yù)先轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D,后給予AGE-HSA刺激,能促進AGE-HSA引起的內(nèi)皮細胞通透性增高。結(jié)果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞高通透性,而pcDNA3-HA-moesinT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞高通透性,并與AGE-HSA刺激有協(xié)同作用。 (2)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDN A3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對AGE-HSA介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞細胞骨架肌動蛋白F-actin形態(tài)及分布變化的影響 正常情況下,內(nèi)皮細胞骨架F-actin主要分布在細胞周邊,線條完整連續(xù),顯示出內(nèi)皮細胞的典型鵝卵石樣輪廓,單獨給予AGE-HSA刺激或單獨轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D后,均可見F-actin在胞漿內(nèi)彌散分布,形成非極性單行排列的應(yīng)力纖維,而預(yù)先轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesinT558A,后給予AGE-HSA刺激,可見F-actin仍主要分布在細胞周邊,但F-actin外周致密帶不如正常組規(guī)整連續(xù),相對彌散,但無明顯應(yīng)力纖維形成,與AGE-HSA組相比,有明顯改善。結(jié)果提示：pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞細胞骨架肌動蛋白F-actin形態(tài)及分布變化,而pcDNA3-HA-moesinT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞細胞骨架肌動蛋白F-actin形態(tài)及分布變化。 結(jié)論： 1. AGE-HSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞RhoA活性增高。 2. AGE-HSA通過激活RhoA活性進而導(dǎo)致其下游靶分子ROCK的磷酸化,并通過直接與moesin相互作用激活moesin,最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的改變。 3. AGE/ROCK介導(dǎo)下的moesin蛋白是通過第558位蘇氨酸殘基(moesinT558)磷酸化,進而發(fā)揮其在內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能改變中的作用,抑制該位點的磷酸化可改善這一病理過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：2181294